生物传感分析仪在乳酸发酵中的应用研究
2011-01-03任石苟李奠础许志芳
任石苟 李奠础 许志芳
（1山西轻工职业技术学院，太原030013） （2山西瑞洁生物科技有限公司，侯马043000）
·应用研究·
生物传感分析仪在乳酸发酵中的应用研究
任石苟1*李奠础1许志芳2
（1山西轻工职业技术学院，太原030013） （2山西瑞洁生物科技有限公司，侯马043000）
简述了生物传感分析仪的检验原理，对5个发酵液样品进行了测定，其结果是精密度和测定周期都优于常规分析。
生物传感仪；乳酸；葡萄糖；固定化酶
乳酸菌发酵的特点是边糖化、边发酵，既有淀粉质水解为葡萄糖，又有葡萄糖转化为乳酸。葡萄糖的变化可衡量发酵正常与否，以消耗葡萄糖值的数量来确定发酵水平的高低，及时准确地测定发酵料中残还原糖的含量，以便了解发酵过程中糖类消耗情况。利用先进的跟踪检测技术在人为条件控制下使耗糖、产酸达到最佳状态，将有助于指导发酵生产。
目前，国内乳酸发酵生产中测定还原糖一般采用化学分析法，应用较为普遍的有斐林定糖法。斐林定糖法始于20世纪40年代，至今仍常见于我国的工厂和实验室，是传统的测糖方法，其实质为二价铜在碱性条件下被还原糖中游离羰基还原为一价的氧化亚铜。因此，碱性斐林氏溶液测定的还原糖类应该包括：麦芽糖、乳糖、双糖等具有还原性的糖类。该测定方法的适用范围主要为发酵液中的总糖和残糖的含量。该法操作繁琐，也容易受还原物质的干扰影响测定结果。另外，其结果需由经验数字换算，用标准糖液对照分析，故在分析操作时要严格遵循规定的操作方法进行，否则将会引入较大误差。
生物传感器是利用酶作为分子识别元件，由于酶具有高选择性及专一性的特点，使得生物传感器在样品分析中不需要对样品进行复杂的前处理，实现了简单、快速分析的目的。他是迄今为止能在众多成分存在时，用酶电极法专一性地、快速、准确地定量得到葡萄糖和乳酸含量的方法之一，该方法已纳入国家标准。
1 生物传感分析仪检验原理
SBA-40C型生物传感分析仪是以固定化酶为关键元件，由微电脑控制双指标智能化仪表。他具有两支生物探测电极，可以用一份样品在20 s同时得到两种物质的定量分析结果，同时自动完成冲洗循环，然后进行下一次的测定。可以由电脑自动定标，以达到精确的定量测定结果。
SBA-40C型生物传感分析仪是利用酶促反应来定量，其工作原理为：固定化酶针对性地专一催化某一底物生成葡萄糖酸、丙酮酸等产物和过氧化氢。其反应过程为：
其中：固定化酶有谷氨酸氧化酶、葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶；底物有谷氨酸、葡萄糖、乳酸；产物有（α－酮戊二酸＋NH4）、（丙酮酸+H2O）、（葡萄糖酸+H2O2）。
酶是一种特殊的具有催化活性的蛋白质，他的催化活性随保存时间的延长或测定样品次数的增加而逐步降低。但酶经固定化处理后，这一过程会显著变慢。在固定化酶膜的保存期内，可以近似地把酶的活性看作不变。H2O2电极与固定化酶膜紧贴在一起，酶只在局部位置上起作用。在较短时间内，可以认为缓冲液中样品和H2O2浓度不变。酶膜上底物浓度Sd是缓冲液中的底物向膜内渗透和酶反应分解的综合结果。根据菲克扩散第一定律和酶反应米氏动力学公式，当被测物的浓度很低时（S< 其中，Dd为底物通过支撑膜向酶膜层的扩散系数；S为缓冲液中的底物浓度；t为酶反应时间；Vmax为最大反应速度；Km为米氏常数。因开始测定时Sd=0，计算后得到： 另外，电极表面的H2O2的浓度与酶生成H2O2速度和H2O2向缓冲溶液中的扩散速度有关，电极表面H2O2浓度C与酶反应时间t的关系为： 其中，DH为H2O2通过支撑膜向缓冲液的扩散系数。把（1） 式代人（2） 式得到电极表面H2O2浓度C随时间的变化关系为： H2O2浓度的变化速率达到最大时，d2C/dt=0，此时H2O2浓度变化速率为： 实验表明，对同一酶膜，不同浓度样品达到最大反应速度所需时间t是一致的，所以e-Bt为一常数。在电极表面，H2O2变化的最大速率与被测底物的浓度S成正比。通过测定电极表面H2O2变化的最大速率，并与标准底物作对比，即可计算出被测样品的浓度。 正是基于这一原理，把固定化酶固定在过氧化氢电极上，反应过程中产生的过氧化氢与葡萄糖或L-乳酸含量成正比，过氧化氢与过氧化氢电极接触产生电信号，电信号经过放大处理，可直接显示测定结果。由于产物过氧化氢的量与底物葡萄糖或L-乳酸的量呈线性关系，通过检测过氧化氢的生成量可得到葡萄糖或L-乳酸的含量。 SBA－40C型生物传感仪：山东省科学院生物研究所； SBA系列分析仪专用50mg/dL乳酸、100mg/dL谷氨酸－葡萄糖标准液； SBA系列分析仪专用缓冲剂：每包缓冲剂可配制5000mL缓冲液，使用时，每包缓冲剂加入5000mL蒸馏水，充分摇匀使其完全溶解。 2.2.1 采样 发酵过程中的采样代表着发酵某个时段及运行期间、发酵液中产酸和耗糖的情况，因此样品必须具有普遍性，因此在发酵专用取样口进行取样时，用蒸汽进行灭菌处理后，将料液自由放出一定量后，用发酵液清洗取样杯三次，接取相应数量的料液进行检测。 发酵液样品编号为：1号样品（0 h）、2号样品（12 h）、3号样品 （24 h）、4号样品 （36 h）、5号样品（48 h）、6号样品（60 h）。 2.2.2 样品预处理 取经过滤后的样品1 mL，在容量瓶中用蒸馏水定容至250 mL，使其样品稀释到0 mg/100mL～100 mg/100mL范围内，即为待测样品。用SBA-40C生物传感分析仪对发酵液中的乳酸含量及残糖含量进行测定，缓冲剂为SBA系列分析仪专用缓冲剂。 2.2.3 样品测定 定标：开机后，把50 mg/dL乳酸、100 mg/dL谷氨酸－葡萄糖标准液注入反应池，进样量25 μL，20 s后显示打印数据。反复测定乳酸－葡萄糖标准液，当仪器稳定后，即前后两针的结果相对误差小于1%时，仪器便自动定好标，标志是进样灯（绿灯）一直亮，不闪动。 样品测定：定标后注入25 μL待测发酵液样品于反应池中，20 s后显示打印结果，屏幕显示乳酸含量及葡萄糖含量。见表1。 表1 样品检测打印结果 同时，以斐林氏滴定法进行对比测定。 2.2.4 结果记录 根据样品的稀释情况按以下两个公式分别计算L－乳酸及残糖的含量，计算结果见表2。 表2 样品计算结果 式中：250——稀释倍数； 1 000——单位换算。 采用斐林氏滴定法对同一样品残糖含量进行的测定结果见表3。 表3 裴林氏滴定法测定残糖含量结果 生物传感仪测定的残糖含量结果分析见下页表4、表5、表6。 通过表4～表7分析比较，可以看出应用生物传感仪分析检测样品的精密性较斐林氏滴淀法测定结果要高。 斐林氏检测方法测糖首先需要按照标准要求进行准确的药品配制及标定，检测过程中，除了要进行一定的稀释外，在滴定过程中还需要加热煮沸，消耗的时间较为长，操作繁琐，其结果需由经验数字换算，用标准糖液对照分析，测定周期约为20 min。采用EDTA络合滴定法测乳酸含量，也需进行标准溶液的配制与标定。 SBA－40C生物传感仪可以同时检测发酵液中L－乳酸和葡萄糖的含量，仅仅需要提前进行设备的预热和定标，预热在取样的同时则可以打开仪器使其自行运行，工作人员取回样品后即可进行定标，定标20 s可得到结果，再经25 s自动冲洗行下一次测定，3次定标即可进行样品的检测，测定周期约为 8 min～10 min。 生物传感分析仪具有测定速度快，测定精度高，每次测定的成本低，操作简单的特点。对发酵工序中液化程度也可进行检测。生产实践中，可根据实际情况对样品的稀释度进行调整，从而进一步 的提高生物传感仪检测分析的精密度。另外，如何使生物传感仪实现真正的在线检测，进而实现乳酸发酵的在线控制，将会成为研究人员感兴趣的课题。 表4 1号样品生物传感仪测定残糖含量结果分析 表5 3号样品生物传感仪测定残糖含量结果分析 表6 5号样品生物传感仪测定残糖含量结果分析 表7 斐林氏法测定残糖含量结果分析 ［1］黄洁，宋纪蓉，史红兵，等.苹果发酵液中残余还原糖的测定方法比较［J］.工业微生物，2001，31（3）：38-40. ［2］冯洽平，吴平，罗泽友.生物传感器用于葡萄酒中葡萄糖含量测定的研究［J］.四川轻化工学院学报，2003，16（1）：56-58. ［3］朱思荣，周万里，冯东，等.SBA-70型血糖一乳酸自动分析仪的研制［J］.分析仪器，2004（4）：15-19. Research on the application of biological sensor in lactic acid fermentation RENShi-gou1*LI Dian-chu1XUZhi-fang2 The principle of the biological sensor was introduced.Five lactic acid fermentation samples were detected.The results showed that the accuracyand detection period were better than the normal analysis. biological sensor； lactic acid；clucose；immobilized enzyme TS201.1 A 1673-6004（2011）03-0047-05 *任石苟，男，1964年出生，1988年毕业于无锡轻工业学院（现江南大学）工业发酵专业，工程硕士，讲师。 2011-09-16
2 试验部分
2.1 仪器及试剂
2.2 试验过程：
3 结果讨论
3.1 生物传感仪测定精密度
3.2 斐林氏测定精密度（见下页表7）
3.3 测定精密度比较
3.4 测定周期
4 结论
1（Shanxi vocational and technical college oflight industry,Taiyuan 030013，China）2
（Shanxi ruijie biotechnologycompanyLtd.，Houma 043000，China）
