湖北省油茶资源遗传多样性的SRAP分析

张 婷，刘双青，梅 辉，董妍玲

（1.荆楚理工学院 生物工程学院，湖北 荆门 448000；2.武汉生物工程学院，生物技术系 武汉 430415）

油茶（Camellia oleifera）属山茶科山茶属，是我国南方主要的木本食用油料树种之一.油茶的主要产品茶油，被誉为东方橄榄油，已被广泛地应用于食品、工业、医药、化妆品等领域，具有很高的社会经济价值［1］.

湖北省曾是全国油茶主产区之一，但由于种种原因，油茶产业发展长期停滞不前.近年来，国家和各级地方政府高度重视油茶产业，通过培育良种、规范种植等措施推动油茶产业的发展.目前对油茶的研究多集中在产业现状分析、病虫害防治和田间管理等方面［2－3］，关于油茶遗传多样性的报道较少，仅对油茶无性系的分析中略有涉及.遗传多样性研究是植物种质资源保护、品种改良和开发利用的基础.本研究采用SRAP（sequence－related amplified polymorphism，相关序列扩增多态）技术对我省5个地区油茶进行分析，揭示其遗传多样性水平，探讨其亲缘关系，为我省油茶种质资源的保存、育种和综合利用提供参考.

1 材料和方法

1.1 样品采集

分别于恩施鹤峰、武汉新洲、黄石阳新、咸宁横沟桥和黄冈红安5个地区采集油茶新鲜幼嫩、无病虫害的叶片，放于冰盒中带回实验室，保存于－70℃冰箱.试验样品如表1所示.

表1 油茶样品采集地、代号及数量Tab.1 Localities codes and numbers of Camelliaoleiferain this study

1.2 基因组DNA提取和SRAP－PCR扩增

采用改进的CTAB法提取基因组DNA［4］.采用优化的SRAP反应体系和筛选的11对引物组合对48份样品进行PCR扩增［5］.扩增产物用8%的变性聚丙烯酰胺凝胶银染检测.

1.3 数据分析

每个样品的扩增电泳条带按有（1）和无（0）统计，构成遗传相似矩阵.把0、1矩阵输入POPGENE version 1.32软件计算多态位点百分率（PPB，percentage of polymorphic bands）、Nei′s遗传多样性（H，Nei′s gene diversity）、Shannon′s信息指数（I，Shannon′s information index）、各居群间的遗传分化系数（Gst，coefficient of population differentiation）、Nei′s遗传距离 （D，genetic distance）.根据各居群遗传距离，再利用NTSYS－pc软件按照不加权成对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析.

2 结果与分析

2.1 SRAP扩增结果

11对引物对5个居群的48个油茶样品进行PCR扩增，共获得扩增条带64条，其中具有多态性的条带60条，占93.75%.扩增条带大小集中在100～2 000bp，平均每对引物扩出5.82条带，其中5.45条具有多态性（表2），表明SRAP检测出较多的遗传位点，获得多态性较高的PCR结果，体现了供试材料之间广泛的遗传差异.

表2 油茶SRAP标记的多态性Tab.2 Amplification results from 11primer combinations

2.2 样品的遗传相似性分析

对48份油茶样品的扩增结果进行Nei－Li相似性系数（GS）计算，结果显示来自武汉新洲的1号样品（XZ01）和来自黄冈红安的5号样品（HA05）之间遗传相似性系数最小，为0.469；而来自咸宁横沟桥的3号样品（HGQ03）和来自黄石阳新的4号样品（YX04）间遗传相似性系数最大，为0.906.平均GS值为0.653，变幅为0.437，表明这些油茶样品间差异明显，具有较为丰富的遗传多样性.

2.3 各地理居群的遗传多样性分析

油茶各居群的遗传多样性分析结果见表3.5个居群中等位基因平均数（Na）介于1.437 5和1.703 1之间，平均为1.606 3，有效等位基因数（Ne）介于1.3791和1.5989之间，平均为1.5161，Nei′s遗传多样性（H）介于 0.199 7 和0.320 0之间，平均值为0.274 8，Shannon's信息指数（I）介于0.282 8和0.454 4之间，平均值为0.389 9，PPB 介于43.75% 和70.31%之间，平均为60.59%，其中黄石阳新地区的PPB最低，黄冈红安地区的PPB最高，5个采集地的PPB平均为60.59%；地区间遗传分化系数（Gst）为0.288，即71.2%的遗传变异发生于居群内.

表3 油茶5个居群的遗传多样性分析Tab.3 Genetic variability within populations of C.oleifera

2.4 居群的聚类分析

为了直观分析居群间的遗传关系，将5个居群数据两两相比，计算遗传距离和遗传一致性.各个居群间D值大小在0.066 4至0.371 3之间，其中武汉新洲和黄冈红安的遗传距离最小，黄冈红安和恩施鹤峰的遗传距离最大.基于遗传距离的UPGMA法进行聚类分析，结果如图1.从聚类图中可以看出，5个地理居群分为2大类，WHXZ和HGHA聚为1支，XNHGQ和HSYX聚为1支，这两支再聚成1类，ESHF单独为1类.

图1 油茶5个居群的Nei′s遗传距离UPGMA聚类图Fig.1 UPGMA dendrogram based on Nei′s genetic distance

3 讨论

3.1 SRAP标记

SRAP标记是由美国加州大学作物系LiG于2001年在研究芸薹作物时开发出来的一种基于PCR的标记技术［6］.它的特点在于不需要知道物种中任何基因的序列信息即可进行PCR扩增，具有共显性、简便、稳定、操作简单、重复性强、中等产率等优点，被广泛地应用于物种遗传多样性研究，获得了较高的多态百分率.朱坚等［7］用SRAP分子标记对金针菇种质资源进行评价，在92条扩增带中获得79条多态性条带，多态率为85.9%；左丹丹等［8］对腊梅5个天然群体共150个个体进行SRAP分析，获得了83.41%的多态性.

SRAP标记在本研究中同样表现出较高的多态性，48个油茶样品的平均多态性高达93.75%，高于温强等［9］用ISSR技术对油茶高产无性系的研究（多态比率为 87.96%），与黄永芳等［10］以RAPD技术对90份油茶种质的研究结果相似（多态比率为95.11%）.由此可见，SRAP技术可以作为研究油茶遗传多样性的有效手段，同时也在分子水平上表现出我省较为丰富的油茶资源.

3.2 油茶群体的遗传多样性和遗传分化

居群的遗传多样性与居群的有效等位基因数、Nei′s遗传多样性和Shannon′s信息指数成正相关［11］.根据表3的结果显示黄冈红安群体遗传多样性水平最高，表明其遗传变异最为丰富，提示为最具价值的居群，具有最为丰富的地方品种.在研究的5个群体中遗传分化系数（Gst）为0.288，71.2%的遗传变异发生于居群内，居群内个体间基因交流相对较多，而居群间基因交流相对较少，可能与居群相对隔离，而居群内油茶经营管理粗放、长期采用实生繁殖有关.

3.3 油茶资源的开发利用

油茶在我国已有2000多年的栽培历史，主要分布于长江流域以南的地区，其经济价值高、生态功能强，是一次种植、多年受益的树种［12］.湖北属于中国油茶的北带产区，并为该带的核心区.但由于在相当长的时期内，未对油茶生产给予正确引导和必要支持，致使油茶品种混杂，良种的选育与推广明显滞后于湘、赣、桂等省［13］.因此今后在油茶育种工作中，应该更加有意识地利用现有种质资源，重视亲本的选择，选择亲缘关系较远的居群作为亲本，有目的地扩大亲本的遗传基础，避免后代的遗传背景过于单一.本文聚类分析结果将5个居群分为两大类，为今后的杂交育种工作中亲本的选配提供理论依据.

［1］王 峰.茶栽培技术［J］.现代农业科技，2009（17）：40－41.

［2］吴 涛.江西油茶主要病虫害及其防治技术［J］.现代农业科技，2008（3）：92－93.

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［4］Doyle J J，Doyle J L.Isolation of plant DNA from fresh tissue［J］.Focus，1990（12）：13－15.

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