胶原三肽的抗氧化功能研究

杨国燕 陈栋梁 陈 龙 王阿敬

刘 莉 成 静 陈大伟 汪 丽

（武汉肽类物质研究所，湖北 武汉 430023）

胶原三肽的抗氧化功能研究

杨国燕 陈栋梁 陈 龙 王阿敬

刘 莉 成 静 陈大伟 汪 丽

（武汉肽类物质研究所，湖北 武汉 430023）

研究CTP（胶原三肽）的抗氧化功效并与两种大分子胶原肽进行比较。体外试验采用螯合Fe2＋和清除DPPH自由基能力的方法；体内试验采用“D－半乳糖皮下注射制备小鼠衰老模型”，以受试小鼠SOD和GSH－PX活力、MDA含量为检测指标，考察CTP等胶原肽产品的抗氧化性能。结果表明，在相同浓度下，CTP螯合Fe2＋和清除DPPH自由基的能力均高于对照产品；在相同剂量下，胶原三肽能显著提高衰老小鼠体内SOD活力，降低MDA含量，并优于对照产品。与大分子胶原肽相比，胶原三肽具有较强的抗氧化活性。

胶原三肽；抗氧化；体外；体内

胶原蛋白具有显著的低免疫原性、生物相容性以及可降解性，在生物体易被吸收，具有亲水性强、无毒安全性好等特殊性能［1－2］，因此成为最有用的天然高分子生物材料之一，被广泛用于食品、化妆品、医药等工业领域。胶原多肽（collagen polypeptide）是胶原蛋白或明胶的水解产物，具有降血压、降胆固醇、促进Ca2＋吸收、抑制光老化等多种生理活性［3－5］。近年来，研究［6］表明小肠对胶原多肽的吸收率高于对氨基酸和胶原蛋白的吸收率。

通过最新定向限制性酶切技术获得的胶原蛋白水解产物，其中富含低聚微肽（mini－peptide），主要是含三个氨基酸的胶原三肽（collage tripeptide，简称CTP），其结构可简单地表示为“Gly－X－Y”，平均分子量约为280U［7］。由于CTP分子量很小，因此能极有效地渗入角质层、真皮层和头发根部细胞内［7］。有研究［8］表明，CTP具有抑制动脉粥样化、促进骨伤愈合等特殊功能。

目前，对酶解胶原多肽及其活性的研究较多，但对胶原三肽抗氧化功能研究的报道却很少。本试验重点研究了采用定向限制性酶切技术制备的胶原三肽的体外螯合Fe2＋和清除DPPH自由基的能力，以及对D－半乳糖诱导衰老小鼠模型体内抗氧化能力等方面的影响，并与大分子胶原肽比较，以期为胶原三肽在食品和美容化妆品中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验原料

胶原三肽（CTP）：武汉天天好生物制品有限公司；

普通胶原肽1（CP1）、胶原肽2（CP2）：市购。

1.1.2 试剂与药品

SOD（超氧化物歧化酶）、GSH－PX（谷胱甘肽过氧化物酶）和MDA（丙二醛）测试盒：南京建成生物技术公司；

细胞色素C（MW：12 588U），胰岛素（5 733U），杆菌肽（1 423U），甘氨酸－甘氨酸－酪氨酸－精氨酸（451U），甘氨酸－甘氨酸－甘氨酸（189U）和Ferrozine（菲洛嗪）、DPPH（2，2－二苯基－1－间三硝基苯基联肼）：美国Sigma公司；

氯化亚铁：分析纯，台山市联兴化工有限公司；

无水乙醇：分析纯，上海振兴化工一厂；

D－半乳糖：分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 试验动物

小白鼠（雄性）：昆明清洁级，华中科技大学实验动物中心。

1.1.4 主要仪器设备

电热恒温水浴锅：DK－98－II型，天津市泰斯特仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：T6新世纪型，北京普析通用有限责任公司；

电子天平：AR2140型，奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；

高速台式离心机：TGL－16G型，上海安亭科学仪器厂；

高效液相色谱：Agilent 1100型，美国安捷伦公司。

1.2 试验方法

1.2.1 理化指标测定

（1）水分：参照GB/T 5009.3——2010进行测定；

（2）灰分：参照GB/T 5009.4——2010进行测定；

（3）蛋白含量：参照 GB/T 5009.5——2010进行测定；

（4）多肽含量：参照 GB/T 22729——2008进行测定；

（5）分子量分布：采用HPLC法测定。

色谱柱：TSKgel G2000SWXL300mm×7.8mm，柱温：室温，流动相∶乙腈＋水＋三氟乙酸＝45＋55＋0.1，波长220nm，体积流量0.8mL/min。

分子量分布标准曲线制作：分别用流动相配制成质量分数为1mg/mL的细胞色素C、胰岛素、杆菌肽、甘氨酸－甘氨酸－酪氨酸－精氨酸、甘氨酸－甘氨酸－甘氨酸标准品溶液，按一定比例混合后进样，得到标准品的色谱图，以相对分子质量的对数对保留时间作线性回归得到相对分子质量校正曲线及其方程。

样品处理：将样品稀释5倍，过滤，取滤液20μL上样。

分子量分布的计算：用GPC数据处理软件，将样品的色谱数据代入校正曲线中进行计算，即可得到样品的相对分子质量及其分布范围。

1.2.2 螯合 Fe2＋能力的测定 参考 Chung的方法［9］，取1.5% 的胶原产品水溶液5mL，分别加入2mM FeCl2溶液0.1mL及5mM Ferrozine溶液0.2mL，反应10min，于562nm测其吸光值。空白用0.2mL水代替Ferrozine溶液，对照试样为蒸馏水。螯合率按式（1）计算：

1.2.3 清除自由基DPPH能力的测定方法 参考Bernard等的方法［10－11］，分别取一定浓度的胶原产品水溶液2.5mL，加入2.5mL无水乙醇，分别加入新鲜配制的0.4mM DPPH乙醇溶液1mL，呈深紫蓝色，混合均匀，避光反应15min。用分光光度计在517nm波长下，测定其吸光值。以无水乙醇溶液为空白，以5mL无水乙醇加1mL DPPH乙醇溶液为对照。DPPH自由基清除率按式（2）计算：

以样品浓度对DPPH自由基清除率作图，可以得到清除50%DPPH自由基时所需样品的浓度，即IC50。

1.2.4 动物试验 小白鼠70只，体重25～30g。试验分为5组，分别为空白组，模型组，CTP组，CP1组，CP2组。

灌胃剂量：将动物适应性喂养2～3d，空腹12h后称体重，按体重随机分组，试验共进行55d。受试组按1.33g/（kg·bw）给动物灌胃样品，空白对照组和模型对照组给予相应量的蒸馏水。试验期间每周测体重1次，并根据体重状况调整灌胃剂量。

衰老模型小鼠的制备：试验采用D－半乳糖衰老模型，造模与灌胃同时进行。除空白对照组外，其余组均用D－半乳糖颈背部皮下注射（1.0g/（kg·Bw））。每周称1次体重，根据体重调整剂量，连续注射55d。

灌胃第55天，首先眼球取血（离心收集血清用于SOD和GSH－PX指标检测），然后分取肝组织0.10～0.20g加生理盐水用玻璃匀浆器研磨成5%匀浆液，离心取上清液测定MDA含量。超氧化物歧化酶活力测定、谷胱甘肽过氧化物酶活力测定、丙二醛含量测定均按照试剂盒内说明书的方法进行检测。

1.2.5 数据处理 试验结果用±s表示，用SAS统计软件对数据进行t检验和方差分析。

2 结果与分析

2.1 胶原肽的理化指标

由表1、表2可知，3种胶原产品的灰分、蛋白质及多肽含量的检测结果较为接近，但分子量分布有较大区别。CP1大于1 000U的占41.2%，CP2大于1 000U 的占35.7%，而CTP大于1 000U的仅占9.5%，分子量大部分集中在200～500U之间，含量占50%以上。

表1 不同胶原产品的理化指标Table 1 The guide line of physics and chemistry of different collagen /%

表2 不同胶原产品的分子量分布Table 2 The molecular weight distribution of different collagen

2.2 体外抗氧化试验

将各受试物配制成1.5%溶液测定亚铁离子螯合率，如表3所示，分子量分布主要在200～500U的CTP的螯合率最高，分子量分布主要在500U以上的CP的螯合率较低。

表3 体外抗氧化功能测定结果的比较ńTable 3 Comparison of the result of anti－oxidation in vitro（n＝7，x±s）

表3 体外抗氧化功能测定结果的比较ńTable 3 Comparison of the result of anti－oxidation in vitro（n＝7，x±s）

ń ＊＊与CTP组有显著差异（P＜0.01）。

名称 螯合率/% DPPH IC50/（mg·mL－1）CTP 60.05±1.34 11.0±0.1 CP1 21.68±0.53＊＊ 22.2±0.1＊＊CP2 28.52±0.62＊＊ 25.6±0.1＊＊

将各受试物配制成不同浓度溶液，测定DPPH自由基清除率，并计算IC50。IC50值越小，表明该物质清除自由基能力越强。如表3所示，分子量分布主要在200～500U的CTP的DPPH清除自由基能力最高，分子量分布主要在500U以上的清除DPPH自由基能力较低。

2.3 体内抗氧化试验

2.3.1 丙二醛（MDA）的测定 小鼠肝组织丙二醛的测定结果见表4。

表4 MDA测定结果的比较ńTable 4 Comparison of the result of MDA （n＝14，x±s）

表4 MDA测定结果的比较ńTable 4 Comparison of the result of MDA （n＝14，x±s）

ń ＊与空白组有显著差异（P＜0.05），▲与模型组有显著差异（P＜0.05），＃ 与CTP组有显著差异（P＜0.05）。

组别 动物数 MDA/（nmol·mg－1PROT）14 1.56±0.43模型 14 2.44±0.88＊CTP 14 1.34±0.81▲CP1 14 1.99±0.58 CP2 14 2.20±0.95空白＃

由表4可知，与空白对照组相比较，模型对照组丙二醛的平均含量显著高于对照组，表明小鼠经半乳糖造模已引起肝脏脂质过氧化。与模型对照组相比较，CTP组的丙二醛平均含量显著低于模型对照组。而且CTP组的丙二醛平均含量显著低于CP2组。

2.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）的测定 小鼠血清SOD活力的测定结果见表5。

表5 SOD测定结果ńTable 5 Comparison of the result of SOD（n＝14，x±s）

表5 SOD测定结果ńTable 5 Comparison of the result of SOD（n＝14，x±s）

ń ＊与空白组有显著差异（P＜0.05），▲与模型组有显著差异（P＜0.05），▲▲与模型组有极显著差异（P＜0.01），＃与CTP组有显著差异（P＜0.05）。

组别 动物数 SOD/（U·mL－1）14 157.9±26.0模型 14 114.9±33.1＊CTP 14 152.1±15.5▲▲CP1 14 131.7±19.4＃CP2 14 146.1±19.0空白▲

由表5可知，与空白对照组相比较，模型对照组的SOD活力降低，且差异显著，说明造模成功。与模型对照组相比较，CP2组的SOD活力显著高于模型对照组，CTP组的SOD活力极显著高于模型对照组。表明CTP恢复机体SOD活力强于CP2。而且CTP组的SOD活力显著高于CP1组。

2.3.3 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－PX）的测定 小鼠血清GSH－PX活力的测定结果见表6。

表6 GSH－PX测定结果ńTable 6 Comparison of the result of GSH－PX（n＝14，x±s）

表6 GSH－PX测定结果ńTable 6 Comparison of the result of GSH－PX（n＝14，x±s）

ń ＊与空白有显著差异（P＜0.05），▲与模型有显著差异（P＜0.05）。

组别 动物数 GSH－PX（活力单位）14 605.1±158.3模型 14 522.9±152.2 CTP 14 528.5±101.0 CP1 14 529.2±128.7空白CP2 14 523.5±111.6

由表6可知，空白对照组、模型对照组和各受试组的血清GSH－PX均无显著差异。

3 讨论

近年来，很多学者开始专注于研究胶原肽对机体氧化和过氧化平衡的影响。刘小玲等［12］自制90%以上相对分子质量低于10kU的胶原肽，发现其对由Fe2＋引发的卵磷脂脂质体过氧化有一定抑制作用，同时对·OH具备一定的清除作用。还有学者［13－14］研究发现，以四氧嘧啶诱导的糖尿病鼠经灌胃海洋胶原肽（3.25g/（kg·Bw））能显著增加肝脏SOD活力，降低肝脏MDA含量，保护肝肾功能；以D－半乳糖诱导的衰老大鼠经灌胃海洋胶原肽（0.45，1.35g/（kg·Bw））能显著增加血清SOD活力，降低血清MDA含量。以上试验都证明胶原肽具有一定的抗氧化作用。

通过两种体外抗氧化能力测定结果可见，相对分子质量集中在200～500U的胶原三肽的螯合亚铁离子能力和清除DPPH自由基能力均优于大于1 000U的占35%以上的大分子胶原肽，在一定程度上抑制由金属离子产生的自由基对人体造成的伤害，能更有效的阻断脂质过氧化反应。

体内试验采用半乳糖衰老模型，半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。半乳糖属于皮下吸收，其过氧化产物及机体产生的抗过氧化酶类也主要集中于体液中。本试验造模效果为：模型组的SOD活力和MDA含量与对照组相比差异显著，并呈阳性，表明造模成功。D－半乳糖攻击机体产生自由基，导致机体内SOD活力下降，自由基过氧化物MDA含量增加。在相同剂量（1.33g/（kg·Bw））下，CTP组的SOD活力和MDA含量较对照组呈阳性结果，尤其是CTP组的SOD活力有极显著增加，表明CTP有很高的抗氧化活性，能提高SOD活力，降低MDA含量。大分子的CP2仅SOD含量较对照组呈阳性结果。根据中华人民共和国《保健食品功能学评价与检验方法规范》中抗氧化试验的结果判定准则：抗氧化酶活性任一指标和过氧化脂质含量指标均为阳性，可判定该受试样品具有抗氧化作用。提示CTP具有抗衰老（抗氧化）功能，而大分子的CP1、CP2无抗衰老（抗氧化）功能。3种受试物中CTP的相对分子质量集中在200～500U，分子量最小，其抗氧化功效最强，初步说明抗氧化效果随相对分子质量减少，空间位阻减小而增强，然而CTP被人体吸收后如何代谢等问题尚不清楚，还需进一步研究探讨。

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Study on the antioxidant function of collagen tripeptide

YANG Guo－yan CHENDong－liang CHEN Long WANG A－jing

LIU Li CHENG Jing CHENDa－weiWANG Li

（Wuhan Peptide Substance Research Institution，Wuhan，Hubei430023，China）

The antioxidant function of collagen tripeptide was investigated and compared with two kinds of high molecular weight collagen peptide.The vitro antioxidant function of CTP and other similar products was assayed by chelating ferrous ion and clearing the DPPH·method.The antioxidant function in vivo of CTP and other collagen peptides was assayed by D－galactose aging model mice prepared by subcutaneous injection as the experiment animals.The detection index included superoxide dismutase activity，glutathione peroxidase activity（antioxidant enzyme activity）and malondialdehyde content（lipid peroxide content）.The collagen tripeptide produced has much higher chelating ferrous ion and clearing the DPPH·antioxidant activity than other collagen peptides at the same concentration.The collagen trieptide can enhance the SOD activity and reduce the MDA content，which has a high vivo antioxidant activity than other collagen peptides at the same dosage.Compared with two kinds of high molecular weight collagen peptide，CTP has better antioxidant function.

collagen tripeptide；antioxidant；in vitro；in vivo

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

杨国燕（1979－），女，中国多肽产业集团助理研究员，硕士。E－mail：tallyho－peptide＠163.com

2010－07－12