时间分辨在检测抗-HBs的优势应用

娄宏哲

我国现有1.3亿乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBS)感染者，定量检测乙型肝炎病毒抗-HBs的滴度可对接种疫苗的效果进行评估，用于判定是否需要加强免疫，还可以评估普通人群免疫力。目前国内抗定量分析有各种化学发光法和放射免疫分析，这些方法因仪器试剂昂贵或者需要使用放射元性素而无法普及应用，时间分辨荧光免疫分析采用非放射免疫标记技术，能定量检测乙型肝炎病毒标志物，是特异性及灵敏度均较高的一种新的检测方法。

1 对象与方法

1.1 研究对象 检测226例标本，为某单位职工注射疫苗1年后体检抽取。空腹采静脉血3 ml置促凝管内，3500 r/min离心取血清备用。

1.2 方法与试剂 时间分辨采用中山达安基因股份有限公司胶体金方法采用广州万孚生物技术有限公司ELISA方法采用上海科华生物技术有限公司。

1.3 实验原理 TRFIA法检测采用双抗原夹心分析法。用HBsAg包被反应板，加入定标品或待测样品，样品中的抗-HBs与已包被的HBsAg结合成抗体-抗原复合物，再加入铕标记的 HBsAg，形成 HBsAg-抗-HBs-HBsAg-DTTA-Eu复合物。增强液将复合物上的Eu3+解离到溶液中，并与增强液中的有效成分形成高荧光强度的螯合物，其荧光强度与样品中的抗-HBs浓度成正比。通过标准曲线得到样本中抗-HBs的浓度。胶体金方法试剂条上以胶体金为标记包被重组乙肝表面抗原，应用免疫层析原理检测样本中的抗-HBs。抗-HBs采用双抗原夹心法检测标本中抗-HBs。

1.4 仪器 泰莱-Ⅰ型半自动时间分辨分析系统，FWI-ⅠMICRO-DSCILLATOR振荡器，DEMⅢ型自动酶标洗板机，GDVDV990BV4酶标仪。

2 操作与结果

2.1 结果判定 TRFIA法定量检测值＞10IU/L，判为阳性。ELISA法定性cut off(CO)为阴性对照孔OD均值N×2.1，样品OD值S/CO≥1为抗-HBs阳性。胶体金法在检测区(T)及对照区(C)各出现一条红色反应线为阳性。

2.2 结果比照

表1 TREIA法、ELISA法与GICA法检测结果比照(例)

时间分辨的方法和ELISA与胶体金的方法阳性吻合率分别为98.6%和97.7%。

3 讨论

目前测定抗-HBs的免疫学方法主要有ELISA、CLIA、ECLIA、RIA、胶体金免疫层析法(GICA)、斑点金免疫渗透法(DIGFA)、微粒子酶免疫分析(MEIA)、TRFIA 法等［1］。

医学上研究乙肝和乙肝防治，特别是观察疗效，都需要定量的分析手段。时间分辨荧光分析(TRFIA)是以稀土离子标记抗原抗体、核酸探针和细胞等为特征的超灵敏度检测技术，用生物素、酶等大分子标记物，须通过一系列化学反应来检测，其过程受影响因素较多，用原子直接标记，避免了各种不利因素的影响。它克服了酶标记物的不稳定性、化学发光仅能一次发光及一般荧光标记受环境干扰的难点，通过时间延迟和波长分辨，使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的性噪比，从而大大的超过了放射性同位素所能达到的测定灵敏度。

有资料表明，抗-HBs的含量在10 mIU/ml以上的人群并不代表机体都一定具有免疫力。抗-HBs含量在10～100 mIU/ml之间的人群对HBV的免疫力弱，甚至不能预防HBV感染。只有抗-HBs的含量达到100 mIU/ml以上时，才有能力抵抗HBV的入侵;其含量越高，机体抵抗HBV入侵的能力越强［2］。同时，分析HBsAg和抗-HBs浓度的变化，可预见急性乙肝是否处于恢复期。若HBsAg浓度降低，抗-HBs浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展。反之，HBsAg浓度处于较高水平或上升趋势，而抗-HBs一直处于较低水平，则易发展为慢性乙肝或病毒携带者。德国终身预防接种委员会乙肝疫苗复种方案说明:抗-HBs在10～100 mIU/ml，每3～6个月复查1次;抗-HBs＞100 mIU/ml，10年后才需要加强一针;2.1～10.0 mIU/ml认为是对乙肝疫苗接种效果差;0.～2.1 mIU/ml认为是对乙肝疫苗接种无效果。有文献报道9次注射乙肝疫苗仍检测不到抗-HBs。对此有关专家曾进行不少观察与研究，除增加接种次数提高阳性率外，接种剂量对抗-HBs的产生也呈正相关，有人用 20 μg ×3，30 μg-30 μg-10 μg，30 μg×3三种方法的免疫效果相同，与10 μg×3相比也有非常显著性差异，另外也有报道，改变第二次与第三次注射的间隔时间可以提高免疫效果［3］。因此为了提高乙肝疫苗的免疫效果呢，除及时检测抗-HBs采取补救措施外尚需要根据其他学者的改进措施进一步探索。

在实验过程中也发现操作时差不可避免的对结果有影响，在室温(18℃ ～25℃)下手工加样设备加完一块板需时10 min而导致的弱阳性标本及高值阴性标本的检测值结果的差异客观存在，因此初试中对于高值阴性标本应进行双孔复试，且复试时应保证加样顺序的优先性。TRF操作过程中还应注意TRF抗-HBs的铕标志物溶解后，易受环境中稀土元素污染而出现假阳性，需在1个月内用完，否则测定结果将会受影响［4］。

酶联免疫法的特点在于它的操作简便，适用于大批量标本的检测，且成本低廉，其灵敏度也很好，但无法定量，只能满足临床对单纯阴、阳性结果的判定。对抗-HBs阳性结果是否具有保护意义无法提示。而且要注意其一些影响因素，如实验室恒温水箱、移液器、酶标仪之间的差异及操作人员手法间的区别等;甚至加完终止液到酶标仪读测的时间长短也会造成结果的不一致。内源性物质(补体、AFP、RF、自身抗体)的干扰和外源性物质(血液抗凝剂)、试剂盒质量(特别是抗原包被的质量)等均可影响ELISA检测结果准确度，对其检测的弱阳性标本应复查，以减少误报。

快速胶体金渗率检测板检测乙肝血清标志物漏检的原因:①加样量的不足或过多，可造成结果的误判;②温度影响:温度过低，反应速度降低，在规定时间内弱阳性结果不能完全显现出来，造成误判;③快速胶体金渗率检测板极易受潮导致结果误判;④快速胶体金渗率检测板检测时水平位置的不同，影响血清扩散速度而造成结果误判［5］。

通过以上分析，时间免疫分析法是近几年迅速崛起的新方法，灵敏度高，标记物制备简便，储存时间长，无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、应用范围十分广泛等优点，成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新的里程碑。

［1］魏来，陶其敏.努力规范肝脏疾病的免疫学诊断.中华检验医学杂志，2003，26(2):69-70.

［2］乔艳红，谷泽亮，张湔，赵京超.乙肝病毒表面抗体TRFIA方法的建立及其应用.标记免疫分析与临床，2005，3:24-26.

［3］林青.注射乙肝疫苗后不同阶段的表面抗体浓度测定分析.湖南医学，2006，17(2):130-131.

［4］王福俊，罗佳臻.两种方法检测低浓度乙型肝炎病毒表面抗体的探讨.检验医学与临床，2007，4(6):485-487.

［5］李辉，卞文安.快速胶体金渗滤检测板与ELISA法检测乙肝血清标志物的对比分析.新疆医科大学学报，2006，1(29):132-135.