牛肝菌中的尼古丁成因研究报告

彭云霞 马晓刚 李云飞 熊 清 赵永昌 车泉 刘自强

(1.云南出入境检验检疫局技术中心,昆明 650028;2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,昆明 650054;3.云南省牛肝菌协会,昆明 650032;4.中国食品土畜进出口商会食用菌分会,北京 100062)

1 研究方法及样本

1.1 检测方法 本项目组所采用的检测方法是中国正式公布的由云南CIQ实验室同EUROFONS苏州实验室共同起草的进出口行业标准SN/T2397-2009《进出口食品中尼古丁检测方法》,同时近期云南CIQ实验室还参加了欧盟基准实验室CRL组织的国际实验室间能力验证实验,检测结果满意。2009年11月4～5日在德国汉堡由欧盟ESA协会主办的中欧尼古丁成因研究会上确认:EUROFINS方法为尼古丁筛选检测方法,云南CIQ方法为确证方法。

1.2 样本采集 各类牛肝菌样本700份,其中鲜样100份,速冻鲜样73份,盐渍加工样品59份,干片468份;其他食用菌干片样本96份。对云南主产区及四川、东北的食用菌生长周边环境样本55份进行尼古丁含量的检测,其中根系土壤样品30份,水样品10份,大气样品15份。实验室培养的人工菌丝体4种,分别是:本研究在实验室内人工培育的羊肚菌 (Morchella esculenta)、暗褐色网柄牛肝菌 (Phlebopus portentosus)、黑曲霉 (Aspergillus niger)、青霉菌 (Penicillum sp.)。

2.2 样本来源 云南食用菌主产区的样本由项目组到产地直接采集后在实验室进行加工,其采集加工过程经严格控制,保证样本不受外界环境的污染;欧洲区的牛肝菌干片样本是在欧盟市场上购买;中国其他产区的实验样本由云南省牛肝菌协会会员在当地收购后提供;大气样本委托云南省楚雄、思茅、丽江环境监测站对当地大气环境按相关技术规范进行采集所得。

2.3 菌丝体培养方法 真菌菌丝体由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供,其菌丝体培养条件:试验菌株在YPDA(0.2%酵母膏,0.2%蛋白胨,2%葡萄糖,1.2%琼脂粉)斜面上于25℃下培养7～8天,培养的菌丝接入YPD液体培养基 (500 mL的三角瓶装入200 mL的培养基),接种后摇床振荡培养 (25℃,150 r/min)10天,每个菌株设3个重复。培养好后采用离心收集法收集菌丝体,8 000 r/min离心20 min菌丝体培养液,弃上清收集沉淀即为培养所需的菌丝体,于40℃下储存备用。同时使用不接入菌丝的培养基同上述操作条件同步培养作空白对照试验。

为保证实验结论的科学准确,本项目研究组专门送9份比对样本到EUROFINS苏州实验室进行检测,同期收集了由中国出口商送至德国第三方实验室检测所得结果的数据,对其进行分析研究。

2 试验结果

2.1 项目研究组的检测结果数据 具体数据详见表1～表7。

表1 人工培育的菌丝体中的尼古丁含量

表2 云南产区鲜牛肝菌子实体样本的尼古丁含量

表3 云南产区牛肝菌干片中的尼古丁含量

表4 云南产区速冻及盐渍牛肝菌中的尼古丁含量

表5 其他产区牛肝菌干片中的尼古丁含量

表6 其他食用菌的尼古丁含量

表7 欧洲产区不同等级牛肝菌干片的检测结果

2.2 其他实验室的验证实验结果 EUROFINS苏州实验室对不同等级地区牛肝菌干片的尼古丁含量检测结果见表8;另对产地为云南祥云的A级牛肝菌干片子实体不同部分的检测结果,菌盖的尼古丁含量为3 470μg/kg,菌柄为968μg/kg。

不同加工方式的牛肝菌中尼古丁的含量有差异。据来自云南20个非水洗牛肝菌干片样本和20个水洗牛肝菌干片的检测结果,其尼古丁平均含量分别为1 278μg/kg和678μg/kg,其含量水平各为210～1 300μg/kg和 170～3 540 μg/kg。这两组数据由出口商送往德国第三方实验室检测后所得。意大利对于牛肝菌尼古丁含量分析结果列于表9。

表8 不同等级不同地区牛肝菌干片的检测结果

表9 意大利对干牛肝菌尼古丁含量的分析结果

3 食用菌含尼古丁的成因分析

从上述实验数据中可以看出,尼古丁广泛存在于不同国家、不同地区、不同加工方式、不同种类的野生及人工种植的食用菌中。尽管本研究的实验验证因时间关系还只能作为间接证据,但足以证明食用菌中的尼古丁是内源产生的。

3.1 尼古丁外源性污染的排查 尼古丁可能的污染源包括含烟碱类农药的施用,加工中与烟草的接触污染,以及生长环境中大气、水、土的污染。

(1)输欧牛肝菌的生长环境中含烟碱类农药的施用及污染的排查。牛肝菌是野生产品,生长在海拔1 400米以上的广大山林中,没有必要也不可能更做不到对其施用农药;而中国批准使用的含尼古丁的农药共5种,主要是用在人工种植的柑橘、苹果、茶、小麦、菜豆、黄瓜及十字花科植物中。这些作物主要种植在农田或坡地的无林地上,而牛肝菌生长的区域是有林地,两者的种植区域没有交叉,不会因对其他作物施用农药而对牛肝菌造成污染;在牛肝菌的实际生长区域中,上述作物的种植区主要在居民集中的平地或坡地上,而牛肝菌则是生长在高于这些区域的山地上,由于水从高处往低处流,不会将低地处施用的农药带到高地上;大气循环是在全球很大的一个范围内进行的,局部区域的农药施用并不总会因大气循环而对本区域的植物造成污染,对大气样本的检测数据也说明云南野生菌主产区的大气并不存在尼古丁的污染。

(2)输欧牛肝菌的生长和加工与烟草的接触污染情况的排查。第一,牛肝菌必须生长在较高海拔的林地上,保持比平地或坡地低的温度及较少的阳光直射,而烤烟必须生长在平地或坡地的无林地上,阳光的照射能促进其有机物质的合成,两者的最适生长温度、湿度及光照条件是不一样的,因而其生长区域相距甚远,更不可能交叉,不存在所谓根系延伸污染的问题;且牛肝菌的生长区域海拔高于烤烟种植区域,不存在水流带来的污染。所以,在生长区过程中不会出现因与烟草接触而带来的污染。第二,目前云南出口牛肝菌的生产加工企业是严格按食品加工卫生控制规范要求进行质量监管的,在生产及加工区内严禁吸烟,即使有个别企业管理失范,在生产过程中偶有个别人员吸烟,牛肝菌中的尼古丁也只会出现在个别的产品中,而不会被欧方普遍检出。云南牛肝菌干片的生产方式采用的是传统的热风干燥,这种干燥方式与烤烟房并无任何关系。香味是烤烟最重要的品质指标之一,对烤烟种植者来说,烤烟的经济价值远高于牛肝菌,一旦牛肝菌自身浓郁的芳香气味进入烤烟房内,就会对烤烟气味造成不良的影响,降低其经济价值。因此,云南省烟草行业在全省范围内实施了非常严格的烟草烤房的标准化管理,绝不会允许牛肝菌与烤烟在同一区域内干燥加工的情况发生。

(3)牛肝菌生长环境 (大气、水、土)的污染情况排查。检测结果显示,云南野生菌主产区的大气、土壤、水等环境样本中的尼古丁含量极低,只是PPB级 (1×10-9),而中国四川、东北产区土壤中尼古丁含量同云南食用菌主产区含量相当,云南食用菌的生长环境并不存在尼古丁的污染。同时,包括欧盟国家在内的各类实验室在全球范围内产区的各类野生食用菌中都检出了尼古丁,且其平均含量水平不存在显著差异,证实了各类野生食用菌中尼古丁的存在同环境因素污染无关。如果是人为污染,那么只可能是偶然性地在少数样本中检出尼古丁,而不可能在中欧各个检测机构所有受检的食用菌样本中都检出。

3.2 尼古丁是食用菌产品内源性次生代谢产物的实验论证

(1)鲜牛肝菌子实体尼古丁的检测情况。100份鲜牛肝菌子实体试验样本均由研究人员亲自到产区采集,无一例外地均检出了尼古丁,鲜品中尼古丁的含量在35～65μg/kg。除牛肝菌外,担子菌门中其他科属食用菌中也均可检出尼古丁。被检出尼古丁的食用菌包括:野生菌类中的美味牛肝菌,羊肚菌,松茸,块菌,黑木耳,榛蘑,虎掌菌,鸡油菌,青头菌,冬虫夏草等;人工栽培菌中的香菇、平菇、木耳等。不过,不同种属、不同菌龄间的尼古丁含量水平有所差异。

(2)对实验室内人工培养的4种菌丝体的尼古丁检测情况。结果均检出了尼古丁。除在担子菌门的多种食用菌子实体中及人工菌丝体检出尼古丁外,也在黑曲霉和青霉菌等真菌的菌丝体中检出。证实了尼古丁是真菌类物种生长过程中普遍产生、存在的一种次生代谢产物,其产生机理有待于深入地研究。

(3)来自世界各产区的牛肝菌干片及其他食用菌产品中均可以检出尼古丁。在2009年11月4～5日“中欧牛肝菌中尼古丁成因研讨会”和2009年12月3日CIAA向欧盟消保司的陈述会上,除本项目组外,法国、意大利、德国等国的研究机构交流的检测数据也毫无争议地证实了这一事实的存在。各国的实验检测数据充分证实含尼古丁的食用菌包括了野生食用菌和人工种植食用菌,两者的生长环境控制和生长方式完全不同。尼古丁广泛存在的事实充分说明食用菌中的尼古丁是一种内源性代谢产物。

4 影响各类牛肝菌中尼古丁含量水平主要因素的实验

各产区的牛肝菌干片中均可检出尼古丁,欧洲4个国家26份样本尼古丁含量为306～1 645μg/kg;云南产区尼古丁的平均含量为986μg/kg(398份样本);中国其他产区50份样本尼古丁的平均含量为822μg/kg。同一产区不同等级的牛肝菌尼古丁含量不等,而不同级别在不同产区的含量并不呈现同样的变化规律 (上表3,5,7,8),说明牛肝菌含量水平同产地无关。但项目研究小组发现等级低的样本尼古丁含量普遍较高,经有针对性的检测分析发现,影响牛肝菌中尼古丁含量的主要因素有以下几种。

表10 受损与未受损样本中的尼古丁含量

4.1 自然受损后的牛肝菌干片中尼古丁含量显著增高 在对同一贸易等级牛肝菌干片的实验发现,自然受损后的牛肝菌干片中尼古丁含量值明显较高 (表10)。这一现象在对新鲜松茸的实验中也同样得到证实,10份受损鲜松茸的尼古丁含量为 157～305μg/kg,而未受损的10份鲜松茸仅为13～77μg/kg。

上述实验结果从内源性次生代谢产物的角度可以得到科学解释:菌体在受刺激后因生物体出于自我保护的应激反应而产生应激物质尼古丁。这种应急反应在生物界的其他物种中也普遍存在。从这一观点出发可以对下述实验结果进行如下解释。

(1)为什么鲜牛肝菌子实体同牛肝菌干片中尼古丁的含量水平并不呈现干鲜比为9倍的关系 (此换算比例应只是适用于外来污染物),而是增高很多。那是因为鲜牛肝菌子实体的干燥过程同样是一种外来损害的刺激,随之不断产生尼古丁直至转换酶失活,从而使尼古丁含量积累增高。

(2)为什么速冻及盐渍牛肝菌中尼古丁检出值较低。其原因有二:一是尼古丁极易溶于水,我们分取速冻菌中水样和速冻菌子实体进行分析,发现其水中尼古丁含量高于子实体部分的含量;二是速冻及盐渍都能很快地使子实体中的反应酶失活,尼古丁产生的时间进程短。

表11 牛肝菌不同样本的尼古丁平均含量

4.2 牛肝菌子实体不同部位的尼古丁含量不一,其孢子产生器官菌管中的含量最高,说明其尼古丁的产生可能与其生殖活动有关。采集鲜牛肝菌样本和对同一子实体牛肝菌干片样本按菌盖和菌柄分别进行检测发现,不同等级菌盖中尼古丁的含量均高于菌柄,其中含量最高部位是菌管,EUROFINS苏州实验室的检测数据也证实了这一点 (表11)。

5 牛肝菌干片中含尼古丁的食用风险评估及相关建议

图1 尼古丁化学结构式

5.1 尼古丁的化学结构及性质 尼古丁又称烟碱,CAS号54-11-5,分子式C10H14N2,相对分子质量162;化学名称为:1一甲基一2(3一吡啶基)吡咯烷,结构式列于图1。烟碱来源于自然界,无残留。天然的烟碱在室温下为无色或淡黄色的油状液体,在20℃下的密度为1.0071 kg/m3,沸点为247℃ 。当pH值大于10时,主要以烟碱分子态存在,能与多种酸反应成盐,所生成的盐大多易溶于水和有机溶剂。

5.2 食用菌中尼古丁的限量合理性问题

(1)一个基本的事实是美味牛肝菌在中欧两国都有悠久的食用历史,从未发生过任何食用安全事件。此外,茄科植物中含有尼古丁是公认的事实,我们检测了番茄和茄子,其尼古丁含量分别为68μg/kg和25μg/kg,皆同鲜牛肝菌相当,而茄子则是WHO/FAO推荐的十大健康食品之一,对其食用并无任何限制。

目前,欧盟对牛肝菌干片的临时限量是2.3 mg/kg,瑞士对干蘑菇的限量为4.5 mg/kg。欧盟制定临时限量的科学依据是什么?如前所述,野生牛肝菌中尼古丁并不是使用杀虫剂后的残留物,而是内源次生代谢产物,因而其限量不应适用396/2005号法规中0.01 mg/kg的限量标准。

(2)确定尼古丁的限量应充分考虑牛肝菌产品的食用方式。据调查,牛肝菌干片的食用方式主要有两类:一是打碎磨细后作为调味料使用,二是直接食用。前者的日摄入量极少,而后者则需要浸泡清洗后再烹制食用,在此过程中微量的尼古丁将被溶解于水中,留在食用子实体中的含量极少。我们将检测过尼古丁含量的牛肝菌干片样本按食用方式先浸泡半小时,取出煮沸半小时后再测试其尼古丁的含量,结果是,处理前两个样本的尼古丁含量各为13 558μg/kg和11 978μg/kg,而处理后的尼古丁含量各为1 007μg/kg和571μg/kg,后者只是前者的1/10～1/20,完全符合现行临时限量标准。因此现时所依据的暴露评估数据并不完善。

以上实验数据已经证实,由于牛肝菌等野生食用菌中尼古丁的含量多少,是人为不可控的,因此要确定野生食用菌中尼古丁的自然本底值是很困难的。同样的事例也发生在香菇中:香菇中的甲醛已被证实为香菇内源性代谢产物,干香菇中的甲醛含量范围为5～1 500 mg/kg,平均含量达266 mg/kg。但现今各主要贸易国并未对香菇中的甲醛制定任何限量标准,因为专家认为,香菇中的氨基酸自然代谢产生的甲醛会在食物的烹饪过程中挥发,不会对人体产生致癌等危害;而尼古丁同样也属极易挥发的物质,其天然含量比甲醛低了近2个数量级,制定限量显然是不合理。欧盟官方应充分考虑到牛肝菌中的尼古丁是内源性次生代谢产物,美味牛肝菌食用历史悠久,不曾出现中毒案例,有必要将尼古丁作为豁免物质,取消对其含量设限的要求,以保证中欧牛肝菌贸易的正常进行,保障产业链上各方的合法权益。