蜂蜡中二十八烷醇的分离纯化技术研究

唐翠芳 吴珍红 缪晓青

（福建农林大学蜂疗研究所，福建省神蜂科技开发有限公司，福州350002）

二十八烷醇的外观为白色粉末或鳞片状晶体，溶点81℃～83℃，比重0.1783(85℃)可溶于热乙醇、乙醚、苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷、石油醚等有机溶剂,不溶于水，对酸、碱、还原剂、光、热稳定，不吸潮[1]。二十八醇广泛分布于动物的表皮和内脏、昆虫分泌的蜡质如虫白蜡、虫胶蜡、蜂蜡以及植物根、茎、叶、壳、籽仁的脂质中[2]。二十八烷醇是世界公认的抗疲劳物质[3～4]。此外，人们对二十八醇的毒性进行了专门研究，通过急性毒性试验证实白鼠LD50=18000 mg/kg(白鼠口服)，安全性比食盐高(食盐LD50=3000 mg/kg)。本研究以蜂蜡为原料，提取其中的二十八烷醇，研究得到高纯度二十八烷醇的制备工艺方法。

1 实验材料

原料蜂蜡（福建省神蜂科技开发有限公司提供），二十八烷醇标品（Sigma公司，纯度99%）；其他均为分析纯试剂。气质联用仪等设备。

2 试验方法

采用“外标标准曲线法”测定二十八烷醇含量[5]。气相色谱条件：岛津GC-2010气质联用仪；电子轰击源（EI）：Toev；色谱柱：RXiTM-5ms；接口温度：260℃；离子源温度：200℃，柱温：80℃以20℃/min升至 300℃保持 10 min；进样量：1μL，进样方式：分流进样；载气：氦气，柱流量：1.46mL/min；Scan扫描方式:50～617.00m/z，SIM 扫描方式:目标离子：104m/z，参考离子：103m/z，78m/z。采用峰面积归一化法定量。

将粗蜂蜡用200目的滤布包裹置于80℃热水中熔融，弃杂，将熔融的蜂蜡静置冷却并加入适量95%乙醇，煮沸20min趁热倒出乙醇溶液，再重复一次。抽滤，再用冷乙醇洗涤两次，除去冷乙醇溶解物。将50g精制蜂蜡和6.79g KOH加入到95%乙醇溶液125mL，在90℃下进行皂化4h，皂化过程中随时摇动三口烧瓶以助充分皂化。以所得的皂化物中粗醇得率为指标，选择最佳萃取溶剂、料液比、萃取温度、萃取时间对皂化物进行萃取。

2.1 萃取溶剂及用量对粗醇得率的影响

50g精制蜂蜡皂化完全后停止搅拌并降温至50℃，然后分别加入100mL苯、甲苯、120#汽油，搅拌30 min，再加入100 mL蒸馏水，搅拌10 min，于50℃保温静置分层，液液相分离，取有机溶剂萃取相于25℃冷析结晶，抽滤，洗涤，得粗醇。重复3次。

萃取剂 100mL，150mL，200mL，250mL 搅拌 30 min，再加入100mL蒸馏水，搅拌10min，于50℃保温静置分层，液液相分离，取有机溶剂萃取相于25℃冷析结晶，抽滤，洗涤，得粗醇。重复3次。

2.2 萃取温度对粗醇得率的影响

取4个500mL三口烧瓶，在每个三口烧瓶中皂化50g精制蜂蜡，皂化完全后停止搅拌，分别降温至50℃，60℃，70℃，80℃，在已确定的最佳萃取剂及其用量条件下搅拌30min，再加入100mL蒸馏水，搅拌10 min，于50℃保温静置分层，取有机溶剂萃取相于25℃冷析结晶，抽滤，洗涤，得粗醇。重复3次。

2.3 萃取时间对粗醇得率的影响

取4个500mL三口烧瓶，在每个三口烧瓶中皂化50g精制蜂蜡，皂化完全后停止搅拌，分别降温至60℃，在已确定的最佳萃取剂量及温度下搅拌30min，40min，50min，60min，再加入 100mL 蒸馏水，搅拌 10 min，于50℃保温静置分层，液液相分离，取苯萃取相于25℃冷析结晶，抽滤，洗涤，得粗醇。重复3次。

2.4 蒸馏水对粗醇得率的影响

取4个500mL三口烧瓶，在每个三口烧瓶中皂化50g精制蜂蜡皂化完全后停止搅拌分别降温至60℃，在已确定的最佳萃取条件下分别加入50mL，75mL，100mL，125mL 蒸馏水，搅拌 10min，于 50℃保温静置分层，液液相分离，取苯萃取相于25℃冷析结晶，抽滤，洗涤，得粗醇。重复3次。

2.5 最佳萃取工艺参数的确定

采用正交试验设计，确定最佳萃取工艺参数。萃取物经过重结晶法进行纯化。

3 结果与讨论

3.1 不同萃取剂及用量对粗醇得率的影响

苯、甲苯和120#汽油萃取后粗醇得率分别为35.13%，38.48%，38.35%，甲苯和120#汽油的萃取效果较好，溶剂性质、溶剂价格、操作难易、毒性和产品收率等因素的筛选，选择120#汽油为最佳提取溶剂，避免苯类强毒性溶剂在试验中对人的伤害。

120#汽油用量分别为 100mL，150mL，200mL,250mL时，粗醇得率分别为32.11%，38.35%，40.08%，40.95%。可以看出萃取剂的用量越大粗醇得率越高，但随着萃取剂用量的不断增加，粗醇得率增加越来越缓慢。萃取剂用量在150mL和200mL时粗醇得率相差1.77%，200mL和250mL时得率仅相差0.87%。从经济角度看萃取剂的用量宜选用150mL。

3.2 萃取温度对粗醇得率的影响

萃取温度为 50℃，60℃，70℃，80℃时粗醇得率分别为 38.35%，40.15%，40.32%，38.17%。60℃和70℃时粗醇得率几乎相等，温度再升高时粗醇得率反而降低，因此萃取温度宜选用60℃。

3.3 蒸馏水对粗醇得率的影响

萃取剂∶蒸馏水（mL∶mL）为 150∶50，150∶75，150∶100，150∶125 时，粗醇得率为 40.15%，42.38%，40.01%，38.65%，当萃取剂与蒸馏水的比例为150 mL∶75 mL时，粗醇得率最高。

3.4 萃取时间对粗醇得率的影响

萃取 30min，40min，50min，60min 粗醇，得率分别为40.15%，41.37%，42.89%，43.41%，萃取时间越长，粗醇得率越高，但随时间的延长粗醇得率增加的速度越慢，50min和60min的得率只相差0.5%。

3.5 最佳萃取工艺参数的确定

在单因素试验基础上随着萃取时间的延长，萃取剂用量的增大，脂肪醇得率逐渐提高；随着萃取温度升高，脂肪醇得率先提高后降低。选取120#为萃取剂，萃取剂用量(A)、萃取温度(B)、萃取时间(C)，萃取剂与蒸馏水比(D)为影响因素，采用L9（34）的正交试验设计来确定最佳皂化工艺参数。

表1 正交试验因素水平

由正交试验结果的极差R的大小得出结论，影响粗醇得率大小的顺序依次为：A＞D＞B＞C，由k值得粗醇得率最高的萃取条件为A2B3C3D2，即萃取时间为50min；萃取温度为70℃；萃取剂与蒸馏水的用量比为 150mL∶75mL。

4 结论

以蜂蜡为原料分离二十八烷醇的最优萃取条件为：萃取剂120#汽油，萃取时间50 min,萃取温度70℃,萃取剂用量150 mL，蒸馏水用量75 mL，将萃取物以三氯甲烷/正己烷（3∶1），固液比为 1∶15，重结晶温度20℃，结晶6次时，可以制得最高纯度的二十八烷醇，纯度为57.28%。

尽管二十八烷醇及其制品的价格相对较高，但由于其独特的功能和安全性，仍然受到消费者的青睐。开发含二十八烷醇的具提高耐力及抗缺氧能力的运动饮料、运动糖果、糕点等产品，市场前景非常广阔。

[1]宋建华,刘正阳,程建新等.新型健康食品添加剂二十八烷醇的开发研究.厦门大学学报(自然科学版)[J],1998,37(3):414～418.

[2]王兴国,刘元法,倪伯文等.二十八醇的分布与功能[J].中国油脂,2002,2:38～40.

[3]Cureton TK.The physiological effects of wheat germ oil on human in experience[M].Sp ringfield?inois,U.S.A,C.C.Thomas Publishesr,1978.

[4]Cureton TK.Effects of wheat germ oil on human in experience[M].U SA,IIIinois,Charles Thomas Publishesr,1972.

[5]陈芳,闰红,蔡同一.气相色谱法测定糠蜡提取物中二十八烷醇和三十烷醇[J].食品科学,2003,24(2):119～121.