利用稻草液体发酵产纤维素酶优化培养基

谭 宏，刘选明，廖红东，谢 骊，梁志坤，廖胜辉，纪鸿雁莫湘涛，邓 乐，王 鑫,朱立超,张元戎

(1.湖南大学生命科学与技术研究院，中国 长沙 410082;2.湖南师范大学生命科学学院，中国 长沙 410081)

纤维素酶(Cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称[1-2]．纤维素酶在食品、饲料、纺织、农产品加工、石油开采和资源再生等方面具有广泛的用途和应用前景；特别是在利用废弃秸秆生产酒精的生物能源开发方面，具有巨大的潜在价值．湖南省农业资源优势明显，每年仅稻草的产量就有数千万吨；合理利用与转化这些纤维素资源对于解决工农业原料来源、能源危机、环境污染等具有重要的意义．本文选用液体发酵产纤维素酶的优良菌株里氏木霉HC-415[3]，在摇瓶阶段，通过正交试验等对稻草培养基中稻草粉与豆粕粉的用量、一级种接种量、一级种培养时间、二级产酶发酵时间、通气量、无机盐等因素进行了研究，确定了优化的培养基配方和产酶条件．为利用稻草液体深层发酵产纤维素酶的研究提供了基础的实验依据．现将结果报导如下．

1 材料和方法

1.1 菌种

里氏木霉(Trichoderma reesei) HC-415．

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基 PDA培养基．

1.2.2 一级种摇瓶培养基 麸皮0.02 g/mL，葡萄糖0.03 g/mL，(NH4)2SO40.001 5 g/mL，pH 5.5～6.0．

1.2.3 二级产酶摇瓶基础培养基 稻草粉，豆粕粉，无机盐等，pH 5.5～6.0．

1.3 主要仪器设备

722S分光光度计；电热恒温水浴锅；Universal 32R 台式冷冻离心机；HZQ-Q全温摇瓶柜．

1.4 酶活性测定方法

1.4.1 羧甲基纤维素酶活性(CMC’ase)测定 DNS法，0.5 mL适当稀释的酶液加入0.005 g/mL CMC-Na溶液1.5 mL．50 ℃ 酶解30 min，加3 mL DNS试剂．沸水浴10 min显色,测还原糖．

1.4.2 滤纸糖酶活性(FPA)测定 参照Mandels、蒋传葵 DNS法[4]．1 mL适当稀释的待测酶液，加入1 mL 0.05 mol/L(pH 4．6)柠檬酸盐缓冲液和1条1 cm×6 cm新华1号滤纸．50 ℃酶解1 h， 加DNS试剂3 mL，沸水浴10 min．显色测还原糖， 扣除空白后计算酶活性．

酶液活性单位规定：1 h水解生成1 mg葡萄糖的酶量为1个活性单位(U)．

2 结果与讨论

2.1 二级产酶培养基稻草粉与豆粕粉的用量对纤维素酶活性的影响

参照文献[3]，此试验中一级种制备为：250 mL三角瓶中，一级种培养基装量100 mL,28～30 ℃全温摇瓶柜中150 r/min培养40 h．二级产酶培养基为：250 mL三角瓶中，培养基装量100 mL；无机盐KH2PO40.005 g/mL，CaCl20.003 g/mL，不加聚醚；一级种接种体积分数为10%,(30±1) ℃全温摇瓶柜中140～170 r/min培养144 h．产酶培养基稻草粉与豆粕粉的用量对纤维素酶活性的影响见表1．

表1 二级产酶培养基稻草粉与豆粕粉用量对纤维素酶活性的影响

从表1可知，稻草粉与豆粕粉的质量比为4∶1时，CMC’ase酶活性较高，平均为85.88 U/mL；6∶1时，FPA酶活性较高，平均为9.8 U/mL．尽管本实验中，用豆粕粉代替了以前使用的豆饼粉，但稻草粉与豆粕粉的质量比仍与以前一样．表明作为氮源的豆饼粉与豆粕粉可以互换使用．在后面的试验中，作者选定的产酶培养基稻草粉与豆粕粉质量比为6∶1．

2.2 一级种接种量等对纤维素酶活性影响的正交试验

采用L9(34)正交表，对一级种接种量、培养时间、二级产酶发酵时间和通气量4因素作摇瓶正交试验．二级产酶培养基中KH2PO40.005 g/mL，CaCl20.003 g/mL；聚醚不加．

2.2.1 实验因素水平安排 见表2，正交试验共进行了两批次．

表2 一级种接种量等正交试验因子及水平安排表

2.2.2 实验结果及分析 对正交试验各摇瓶编号的提取酶液，分别测定CMC’ase及FPA酶活性．分析时同时采用极差分析与方差分析的方法[5]．所得结果见表3和表4．

表3 一级种接种量等因子摇瓶正交试验CMC酶活性结果分析

从表3看，一级种接种量等因子对CMC’ase的影响，通过极差分析其顺序为D>B>A>C,最佳配方为D1B3A2C1；方差分析的显著性顺序与极差分析一致．从表4看，一级种接种量等因子对FPA酶活性的影响，极差分析与方差分析的顺序均为D>B>C>A,最佳配方则为D1B3C1A2．

表明在稻草培养基中，通气量与产酶发酵时间对纤维素酶的生成具有重要作用，尤其是通气量的作用最为显著，通气量D1表明HC-415菌液体发酵产纤维素酶时，耗氧量较高，这是与以前报道不一致的地方[3]．产纤维素酶最佳组合：一级种接种体积分数为15%，二级产酶发酵时间168 h，一级种培养时间24 h，通气装瓶量50 mL．对比9号实验数据，两者结果基本吻合；CMC’ase酶活性最高平均为85.56 U/mL； FPA酶活性最高平均为11.78 U/mL．

表4 一级种接种量等因子摇瓶正交试验FPA酶活性结果分析

2.3 无机盐等因素对纤维素酶活性影响的正交试验

以上述实验结果为基础，采用L9(34)正交表，进一步研究了二级产酶发酵时间、培养基中KH2PO4、CaCl2、聚醚对纤维素酶活性的影响．此正交试验中一级种接种体积分数为15%，一级种培养时间24 h，二级产酶培养基装瓶量为在250 mL三角瓶中装入50 mL．

2.3.1 实验因素水平安排 见表5．正交试验共进行了两批次．

表5 无机盐等正交试验因子及水平安排表

2.3.2 实验结果及分析 对本正交试验各摇瓶编号的提取酶液，分别测定CMC’ase及FPA酶活性．分析时采用极差分析与方差分析的方法．所得结果见表6和表7．

表6 无机盐等因子摇瓶正交试验CMC酶活性结果分析

表7 无机盐等因子摇瓶正交试验FPA酶活性结果分析

从表6看，无机盐等因子对CMC’ase的影响，通过极差分析其影响顺序为C>B>A>D,最佳配方为C3B3A1D1；方差分析的显著性顺序与极差分析一致．从表7看，无机盐等因子对FPA酶活性的影响，极差分析与方差分析的影响顺序则为B>C>A>D,最佳配方为B3C3A1D1．表明稻草培养基中，KH2PO4与CaCl2对纤维素酶的生成具有重要作用，而产酶发酵时间则排到了第三位，聚醚的影响不显著．CaCl2对CMC’ase的生成最重要；而KH2PO4对FPA酶的生成最重要．产纤维素酶最佳组合为：KH2PO40.01 g/mL，CaCl20.006 g/mL，二级产酶发酵时间120 h，聚醚不加．对比3号实验数据，两者结果基本吻合；CMC’ase酶活性最高平均为94.62 U/mL； FPA酶活性最高平均为16.04 U/mL．有文献报道[6]，聚醚作为表面活性剂，一是可以消泡，二是能促进酶分子从菌体表面加速扩散到发酵液里，使酶合成的动态平衡向产酶方向移动，从而增加酶的活性．但本试验中聚醚的影响属于不显著，这是与报道不一致的地方．从表6、表7看，D列的K1、K2及K3值的分布不太合规律．因此，作者认为聚醚对HC-415菌的产酶作用不会太简单，值得今后进一步研究．另外经此优化后，二级产酶发酵时间由2.2中最佳的168 h缩短至120 h，无疑有利于今后工业化的生产．

3 结论

(1) 采用摇瓶平行试验与正交试验相结合研究培养基的优化组成问题，对于以后利用里氏木霉HC-415菌在发酵罐中进行稻草液体深层发酵生产纤维素酶的工业化试验具有重要的指导意义．优化后的培养基组合能明显提高纤维素酶的活性并缩短发酵时间．

(2) 底物浓度及C/N 对纤维素酶的产生有较大的影响[7]．由2.1实验结果，可知里氏木霉HC-415菌对稻草培养基固形物的浓度要求为0.05～0.07 g/mL．超过0.09 g/mL时，酶活性显著降低．产酶培养基中稻草粉与豆粕粉最佳用量比例为4∶1～6∶1．

(3) 综合2.2及2.3实验结果，可知里氏木霉HC-415菌利用稻草液体发酵产纤维素酶时，培养基的通气量、无机盐KH2PO4、CaCl2和二级产酶发酵时间对纤维素酶的生成具有显著性的影响．优化后的稻草培养基最佳产酶时间能缩短2 d．

(4) 表面活性剂聚醚在本实验中对里氏木霉HC-415菌利用稻草液体发酵产纤维素酶的影响不显著，其机理有待进一步的深入研究．

参考文献：

[1] WOOD T M, MCCRAE S l. Sinergism between enzymes involvement in the solubilization of native cellulose[J].Adv Chem Ser， 1979,18(1):181-209.

[2] LEE R L, PAUL J. Microbial cellulase utilization：fundamentals and biotechnonlgy[J]. Microbiol Mol Biol Rev，2002,(9):506-577.

[3] 谭 宏，谢小保，莫 勇. 里氏木霉液体发酵产纤维素酶的研究[J].工业微生物，1996，26(1)：7-11.

[4] 蒋传葵.工具酶活力测定[M].上海：上海科学出版社,1982.

[5] 陈和利.正交设计资料方差分析简便计算法[J].药物流行病学杂志,1998,7(1):40-42.

[6] 黄彬汉. 聚醚对提高纤维素酶的活力初步研究[J].微生物学通报,1987,14(1):6-8.

[7] JIRKU V. Effect of C/N ratio and cellulose type on the cellulolytic activity of free and immobilized Trichoderma reesei[J]. Prog Biotechnol,1996,(11):136-139.