靶向CK1α基因shRNA表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

邹飞雁, 姜少杰, 刘 晓, 李俐娟, 刘婉君

(暨南大学生殖免疫研究所，中国 广州 510632)

人类CK1α基因位于5q32[1]，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族[2]．CK1α参与多种细胞生理过程，包括膜转运、细胞周期、染色体分离、细胞凋亡和细胞分化等．CK1α还参与Wnt/β-Catenin，Hedgehog及NF-κB等信号通路，从细胞膜、细胞质到细胞核均有分布[3-4]，并且在有丝分裂期间，还定位于突触小泡、中心体和纺锤体微管[5]．国外CK1α的功能研究近年开始增多，国内有关CK1α的研究报道甚少[6]．前期实验对CK1α的mRNA和蛋白在肺癌组织中的表达作了初步的探究，发现其在肺腺癌和肺鳞癌均存在不同程度的表达减少，结果表明CK1α与肺癌相关．在此基础上，构建靶向CK1α基因的shRNA表达载体，稳定转染A549细胞，下调CK1α在A549细胞中的表达，并探讨CK1α的表达对A549细胞生长、增殖的影响．

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

图1 pGenesil-1 shRNA表达载体

1.1.1 材料 质粒pGenesil-1(武汉晶赛)，大小4.9 kb，含EGFP标记基因，hU6启动子及多克隆位点(SalⅠ→hU6→BamHⅠ→PstⅠ→HindⅢ)(图1)；大肠杆菌DH5α、肺腺癌细胞株A549和表达载体pEGFP-C1(CK1αLS和CK1αS)本室保存．

1.1.2 试剂 质粒抽提及回收试剂盒(天根)；内切酶(BamHⅠ,HindⅢ,SalⅠ,PstⅠ)，T4 DNA Ligase，T4 Polynucleotide Kinase(PNK)，Taq酶，Premix Taq，Trizol (TaKaRa)；脂质体LipofectamineTM2000 (Invitrogen)；DMEM(Gibco)；胎牛血清(天津TBD)；G418(Genview)；逆转录酶M-MLV(百泰克)；细胞裂解液RIPA中(碧云天)；BCA蛋白定量试剂盒(Pierce)；ECL化学发光试剂盒，羊抗人CK1α多克隆抗体，HRP-驴抗羊二抗，兔抗人GAPDH抗体，HRP-羊抗兔二抗(Santa Cruz)；碘化丙啶(PI)(凯基)；CCK-8(Dojindo)．

1.2 方法

1.2.1 干扰位点及发夹结构的设计 根据GenBank提供的CK1α基因序列，设计3个特异序列(19 nt)作为干扰位点，并在NCBI进行BLAST，排除非特异性抑制其他基因的可能．同时设计1条无义错配序列(19 nt)作为阴性对照，分别命名为CK1α-S1，CK1α-S2，CK1α-S3，CK1α-NK．将4个序列设计成具有发夹结构的shRNA模式(表1)，寡核苷酸片段由上海生工公司合成．

表1 CK1α基因的干扰位点及发夹结构的设计

1.2.2 pGenesil-shRNA重组质粒的构建 寡核苷酸片段的退火→退火片段的磷酸化→pGenesil-1质粒的双酶切(BamHⅠ，HindⅢ)及大片段的回收→磷酸化的退火片段与pGenesil-1质粒双酶切产物的连接→连接产物转化感受态DH5α→阳性克隆的筛选及重组质粒的酶切鉴定→重组质粒的测序．将测序正确的各组重组质粒分别命名为pGenesil-NK，pGenesil-CK1α-S1，pGenesil-CK1α-S2，pGenesil-CK1α-S3．

1.2.3 重组质粒转染A549细胞 将A549细胞种至12孔板，汇合度80%时，用DMEM洗一遍，每孔再加DMEM 1mL；每种质粒各取1 μg，分别加至100 μL的DMEM中，室温30 min；各取4 μL LipofectamineTM2000，用100 μL的DMEM稀释，室温5 min；将上述两者混匀，室温放置30 min，再滴加到12孔板中，前后摇晃混匀，37 ℃，CO2培养箱培养6 h后，吸去转染复合物，用DMEM洗一遍，加含10%胎牛血清的培养基继续培养42 h．

1.2.4 G418筛选建立稳定转染细胞系 细胞转染48 h后，用含G418(800μg/mL)的完全培养基培养15 d后，用有限稀释法挑单克隆并扩增获得稳定株，同时将完全培养基中G418换成维持浓度(400 μg/mL)，筛选出的稳定细胞系分别命名为A549-NK，A549-S1，A549-S2，A549-S3．

1.2.5CK1α基因转录产物的确定 考虑到CK1α基因编码区存在2个插入片段(一个84 nt为L片段；另一个36 nt为S片段)，可形成4种转录变异体(CK1αLS，CK1αL，CK1αS，CK1α)．根据CK1α的基因序列设计引物：上游5′-GGTATTGGGCGTCACTGTAA-3′，下游5′-GGATCCTTAGAAACCTTTCATGTTACTCTTG-3′．预计产物大小：CK1αLS(672 bp)，CK1αL(636 bp)，CK1αS(588 bp)，CK1α(552 bp)．以A549细胞作为材料，RNA由Trizol一步法提取，紫外分光光度计测定浓度和纯度．同时用CK1αLS和CK1αS的表达载体作为模板进行对照(两者的PCR产物分别为672 bp和636 bp)．RT反应条件(20μL体系):总RNA 1 μg，随机引物(0.2 μg/μL)1 μL，RNA Inhibitor (40 U/μL)0.5 μL，dNTP(10 mM)2 μL，5×buffer 4 μL，M-MLV 1 μL，加无酶水至20 μL．42 ℃，60 min，70 ℃，10 min．PCR反应条件(50 μL体系)：RT产物5 μL，上下游引物(20 μM)各1 μL，Premix Taq 25 μL，加无酶水至50 μL．预变性:94 ℃，2 min；变性:94 ℃，30 s；退火:58 ℃，30 s；延伸:72 ℃，1 min；终延伸:72 ℃，7 min；循环数:40．1.5%琼脂糖电泳，紫外灯下观察，拍照．

1.2.6 RT-PCR检测干扰效率 对CK1α基因再设计一对引物：上游5′-GGTATTGGGCGTCACTGTAA-3′，下游5′-GGGAGAAACAAATGCTGCTC-3′，扩增产物(主要为CK1αS)大小641 bp．用GAPDH作为内参，引物为:上游5′-CTGGCGCTGAGTACGTCG-3′，下游5′-TTGACAAAGTGGTCGTTGA-3′，扩增产物大小658 bp．RNA由Trizol一步法提取，并通过紫外分光光度计测定浓度和纯度．

RT反应条件(20 μL体系):同上．

PCR反应条件(25 μL体系):RT产物2.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(10 mM)0.5 μL，上下游引物(20 μM)各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，加无酶水至25 μL．预变性:94 ℃，2 min；变性:94 ℃，30 s；退火:55 ℃，30 s；延伸:72 ℃，1 min；终延伸:72 ℃，7 min；循环数:40．1.5%琼脂糖电泳，紫外灯下观察，拍照．

1.2.7 Western blotting检测干扰效率 RIPA裂解液裂解细胞后，收集蛋白，12%浓缩胶，5%分离胶进行SDS-PAGE电泳；转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉TBST封闭过夜，加一抗(CK1α1∶100，GAPDH 1∶2 000)4 ℃ 4 h；TBST洗涤3次，每次10 min，分别加二抗(辣根过氧化物酶标记)室温孵育4 h；TBST洗涤3次，每次10 min，ECL显色．

1.2.8 A549、A549-NK及A549-S1三者生长曲线的比较 3种细胞在对数生长期时，0.25%胰酶消化，进行细胞记数，分别接种1.0×104个细胞于24孔板，每种细胞接种7孔并平行作3排，每天计数一组，重复3次，绘制生长曲线，并计算A549-S1组的生长抑制率，细胞生长抑制率(IR)=(对照组细胞数目-干扰组细胞数目)/对照组细胞数目×100%．

1.2.9 CCK-8细胞增殖实验 取对数生长期的待测细胞，分为A549、A549-NK及A549-S1组，接种于96孔板中(2×103/孔)，37 ℃ 5% CO2培养，CCK-8法检测细胞增殖，每天分别检测3个复孔，测量A450值，绘制生长曲线，并计算A549-S1组的生长抑制率，细胞生长抑制率(IR)=(对照组A450值-干扰组A450值)/对照组A450值×100%．

1.2.10 细胞流式检测细胞周期 收集2×106个对数生长期细胞，冷PBS洗涤2遍，冷70%乙醇固定，4 ℃过夜，弃除乙醇，PBS洗涤一遍，加500 μL PI(50 μg/mL)染液和10 μL RNase A(50 μg/mL)，避光染色30 min，上机．

1.2.11 统计学处理 实验结果均经SPSS 17.0软件统计，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析，以P<0.05表示有统计学意义．

2 结果

2.1 pGenesil-1质粒的酶切鉴定

pGenesil-1质粒大小4 893 bp，通过BamHⅠ，PstⅠ及HindⅢ单酶切可得约4.9 kb的片段(图2)．

2.2 重组pGenesil-shRNA质粒的酶切鉴定

重组后的pGenesil-shRNA能被SalⅠ切出一条约400 bp的小带，且不能被PstⅠ酶切(图3)．

M:TaKaRa Wide Range DNA Marker (500-12 000); Lane 1:pGenesil-1 plasmid;Lane 2-4: pGenesil-1 plasmid digested by BamHⅠ，PstⅠand HindⅢ图2 pGenesil-1 shRNA表达载体酶切鉴定图

M:TaKaRa Wide Range DNA Marker (500-12 000); Lane 1-2:pGenesil-NK plasmid digested by SalⅠand PstⅠ;Lane 3-4:pGenesil-CK1α-S1 plasmid digested by SalⅠand PstⅠ;Lane 5-6:pGenesil-CK1α-S2 plasmid digested by SalⅠand PstⅠ;Lane 7-8:pGenesil-CK1α-S3 plasmid digested by SalⅠand PstⅠ.图3 重组pGenesil-shRNA酶切鉴定图

2.3 重组pGenesil-shRNA质粒测序

重组质粒的测序结果与设计序列经BLAST比对分析，均为插入正确的重组质粒(图4)．

A:pGenesil-NK; B:pGenesil-CK1α-S1; C:pGenesil-CK1α-S2; D:pGenesil-CK1α-S3图4 重组pGenesil-shRNA测序图

2.4 倒置荧光显微镜观察的结果

在倒置荧光显微镜的可见光和紫外光下对A549、A549-NK、A549-S1、A549-S2、A549-S3进行观察，稳定转染的细胞系几乎所有细胞都均匀表达GFP，而未转染的A549细胞则未见GFP表达(图5)．

A&B:A549、C&D:A549-NK、E&F:A549-S1 、G&H:A549-S2、I&J:A549-S3(A,C,E,G&I under white light; B,D,F,H&J under ultraviolet light)图5 A549、A549-NK、A549-S1、A549-S2、A549-S3在倒置荧光显微镜下观察的结果(200×)

M:ΦX174-HincⅡ digest DNA Marker;Lane 1:PCR product (using pEGFP-C1-CK1αS as template);Lane 2:RT-PCR products (using A549 mRNA as template);Lane 3:PCR product (using pEGFP-C1-CK1αLS as template)图6 CK1α mRNA表达产物的鉴定

2.5 CK1α基因转录产物的确定

根据电泳图，以pEGFP-C1-CK1αS和pEGFP-C1-CK1αLS为模板的PCR产物是588 bp和672 bp的单一产物．而以A549细胞mRNA为模板的RT-PCR产物则主要为588 bp的CK1αS，且依稀可见672 bp的CK1αLS也有微弱表达(图6)．

2.6 RT-PCR检测结果

Quantity One软件分析CK1αmRNA的表达水平，与阴性对照组A549-NK相比，CK1αmRNA在A549-S1中下降84.3%、在A549-S2中下降57.9%，在A549-S3中下降61.8%(图7)，有显著性差异(P<0.001)．

2.7 Western blotting检测结果

Quantity One软件分析CK1α蛋白的表达水平，与阴性对照组A549-NK相比，CK1α蛋白表达量在A549-S1中下降78.4%、在A549-S2中下降51.3%，在A549-S3中下降59.9%(图8)，有显著性差异(P<0.001)．

Lane 1:A549-NK；Lane 2:A549-S1；Lane 3:A549-S2；Lane 4:A549-S3图7 RT-PCR检测CK1α mRNA表达

Lane 1:A549-NK；Lane 2:A549-S1；Lane 3:A549-S2；Lane 4:A549-S3图8 Western blotting检测CK1α mRNA表达

2.8 A549，A549-NK及A549-S1三者生长曲线的比较

通过每天对A549、A549-NK及A549-S1进行细胞计数发现:与A549和A549-NK相比，A549-S1的生长速度明显受到抑制，抑制率=(37.7±2.2)%(P<0.01)(图9)．

2.9 CCK-8细胞增殖实验

以细胞在不同时间的A450值绘制细胞增殖曲线，结果与细胞计数实验基本吻合，相比A549和A549-NK，A549-S1的增殖受到抑制，抑制率=(26.2±1.5)%(P<0.05)(图10)．

2.10 细胞周期分布检测

细胞流式结果显示A549-S1的细胞周期明显改变，与A549和A549-NK相比，A549-S1的S期和G2/M期明显减少(S期减少(75.0±4.0)%，G2/M期减少(45.2±5.4)%)(表2)，细胞主要集中在有丝分裂完成到DNA复制之间的G0/G1期(图11)，细胞增殖受到抑制．

图9 A549、A549-NK和A549-S1的生长曲线

图10 A549、A549-NK和A549-S1的细胞增殖实验

A:A549；B:A549-NK；C:A549-S1图11 细胞周期测定结果

GroupCell cycle distribution/%G0/G1SG2/MA54934.35 63.242.41A549-NK45.61 50.87 3.52 A549-S1 68.02a31.24b0.74a

aP<0.05,bP<0.01, vs A549 and A549-NK.

3 讨论

作者成功构建了CK1α基因shRNA表达载体pGenesil-shRNA，并筛选出稳定转染细胞系．在此基础上，用细胞计数法和CCK-8法绘制了A549、A549-NK和A549-S1的生长增殖曲线，并用流式细胞术检测其细胞周期．实验结果表明，A549-S1细胞增殖速度比阴性对照组慢，S期及G2/M期细胞比例减少，降低CK1α基因在A549细胞中的表达能够抑制其生长．Nicolas Bidère等发现CK1α基因的沉默能抑制原代人T淋巴细胞增殖，对ABC DLBCL(淋巴瘤细胞)更是具有致死性[7]．本研究结果与Nicolas Bidère等的研究结果一致，但与作者前期在肺癌患者新鲜和组织蜡块标本中取得的实验结果相矛盾．

CK1α作为一种激酶，就目前的研究进展来看，其在肿瘤中的作用还存在较大的分歧．在Wnt/β-Catenin和Hedgehog信号通路中，CK1α充当负调控因子，它可以将β-Catenin(Wnt/β-Catenin信号通路的枢纽分子)和Gli 1/2/3(Hedgehog信号通路的枢纽分子)磷酸化并促使β-Catenin和Gli 1/2的降解，而使Gli 3转变成转录抑制子Gli 3R．从而抑制Wnt/β-Catenin和Hedgehog信号通路的激活[8-10]．因此，CK1α被认为是一个候选抑癌基因[11]．

Medrek C等发现CK1α对β-Catenin的磷酸化与β-catenin/E-cadherin复合体的增加有关，且并不导致β-Catenin的降解[12]．而Nicolas Bidère等则发现CK1α能促使CARMA1降解，而抑制NF-κB信号通路；但在NF-κB信号通路异常激活的淋巴瘤细胞ABC DLBCL中，CK1α是重要的正调控因子，CK1α激活NF-κB信号通路对ABC DLBCL的生存是必要的；因而CK1α是一种条件性的恶性基因[7]．Wang Y等发现CK1α能与RIP1相互作用并将其磷酸化，这是RIP1获得活性所必需的，所以CK1α是TNF-α诱导的NF-κB信号通路的正调控因子[13]．Huart AS等发现对CK1α实施RNAi或使用激酶抑制剂D4476可激活P53，同时使转录因子E2F-1不稳定，因而CK1α是p53的负调控因子和E2F-1的正调控因子[14]．Lihong Chen等发现CK1α可与MDMX结合并在Ser289将其磷酸化而调节MDMX，可使MDMX抑制p53的能力增加4倍[15]．这些研究不支持CK1α作为抑癌基因的功能．

由于CK1α作为一种激酶，参与众多生理反应，底物来源相当广泛，作用机制较复杂，推测CK1α的沉默对A549细胞的生长抑制可能是众多调控机制的综合结果，其在信号通路中矛盾的双重功能使其成为一个极其复杂的靶位点．

致谢感谢暨南大学再生医学教育部重点实验室的沈晓涛老师和暨南大学生殖免疫研究所的陈敬同学对本研究的支持和帮助．

参考文献：

[1] ROWLES J, SLAUGHTER C, MOOMAW C,etal. Purification of casein kinase 1 and isolation of cDNAs encoding multiple casein kinase I-like enzymes [J]. Biochemistry, 1991, 88: 9 548-9 552.

[2] BENNETT G S, LASKOWSKA D, DILULLO C. Lithium inhibits the phosphorylation of newly synthesized neurofilament protein, NF-M, in cultured chick sensory neurons [J]. J Neurochem, 1991, 57: 120-129.

[3] KNIPPSCHILD U, WOLFF S, GIAMAS G,etal. The role of the casein kinase 1 (CK1) family in different signaling pathways linked to cancer development [J]. Onkologie, 2005, 28: 508-514.

[4] KNIPPSCHILD U, GOCHT A, WOLFF S,etal. The casein kinase 1 family: participation in multiple cellular processes in eukaryotes [J]. Cellular Signalling, 2005, 17: 675-689.

[5] DUBOIS T, HOWELL S, ZEMLICKOVA E,etal. Identification of casein kinase 1αinteracting protein partners [J].FEBS, 2002, 517: 167-171.

[6] 邹飞雁, 谢海龙, 余艳辉, 等. 肺癌候选抑瘤基因HLCDG1片段的验证及全长序列的克隆[J]. 中国病理生理杂志, 2009, 25(6): 1 081-1 088.

[8] AMIT S, HATZUBAI A, BIMAN Y,etal. Axin-mediated CK1 phosphorylation ofβ-catenin at Ser 45: a molecular switch for the Wnt pathway [J]. Genes & Development, 2002, 16: 1 066-1 076.

[9] WANG Y, MCMAHON A P, ALLEN B L. Shifting paradigms in Hedgehog signaling [J]. Current Opinion in Cell Biology, 2007, 19: 159-165.

[10] HUANGFU D, ANDERSON K V. Signaling from Smo to Ci/Gli: conservation and divergence of Hedgehog pathways from Drosophila to vertebrates [J]. Development, 2006, 133, 3-14.

[11] LIU C M, LI Y M, MIKHAIL SEMENOV,etal. Control ofβ-catenin phosphorylation/degradation by a dual-kinase mechanism [J]. Cell, 2002, 108: 837-847.

[12] MEDREK C, LANDBERG G, ANDERSSON T,etal. Wnt-5a-CK1αsignaling promotesβ-catenin/E-cadherin complex formation and intercellular adhesion in human breast epithelial cells [J]. J Biol Chem, 2009, 284(16): 10 968-10 979.

[13] WANG Y, SUN X, WU J,etal. Casein kinase 1αinteracts with RIP1 and regulates NF-κB activation [J].Biochemistry, 2008, 47(1): 441-448.

[14] HUART A S, MACLAINE N J, MEEK D W,etal.CK1αplays a central role in mediating MDM2 control of p53 and E2F-1 protein stability [J].J Biol Chem, 2009, 284(47): 32 384-32 394.

[15] CHEN L H, LI C G, PAN Y,etal. Regulation of p53-MDMX interaction by casein kinase 1 alpha [J]. Molecular and Cellular Biology, 2005, 25(15): 6 509-6 520.