红汁乳菇菌丝体醇提物对水稻、稗草的化感作用

马红梅， 莫美华， 张耀辉

(1.琼州学院生物科学与技术学院，中国 五指山 572200；2.华南农业大学食品学院，中国 广州 510642)

化感作用(Allelopathy)是指植物或微生物的分泌物对环境中其他植物或微生物的有利或不利的作用[1]．近年来，微生物化感作用的研究取得了很大进展．国外已成功地从微生物代谢产物中开发出草丁膦[2]、除草素A,B[3]、莠去津[4]、二苯醚类[5]等商品除草剂，这些研究多数局限于病原真菌和土壤根际微生物．莫美华等人在采集红汁乳菇时，发现红汁乳菇周围有特殊的蘑菇圈现象，其周围少见双子叶和其他单子叶的草本植物，对它的野生子实体研究发现子实体醇提物具有很强的化感作用[6-7]．然而担子菌的子实体是由真菌的营养菌丝和生殖菌丝缠结而成的，由此让人联想到担子菌的菌丝也可能具有化感作用．本实验用红汁乳菇菌丝体的醇提物对稗草和水稻进行了化感作用的研究，并通过GC-MS联用分析，初步鉴定菌丝体醇提物中化感作用的物质，为红汁乳菇菌丝体进一步开发提供一定的实验依据．

1 材料与方法

1.1 材料

红汁乳菇菌丝体由华南农业大学食品学院微生物教研室提供.

1.2 红汁乳菇菌丝体的无水乙醇抽提液制备

红汁乳菇菌丝体研磨成粉后按1∶30的质量比与无水乙醇混合，于80 ℃回流抽提10 h，抽提液于旋转蒸发仪上60 ℃下浓缩至不再有溶剂后称重，配成7，3.5，1.75，0.875 g/L不同浓度，每个浓度做4次重复．

1.3 生物测定

在90 mm培养皿内放入一张滤纸，湿热灭菌后每个培养皿中各加5 mL上述不同浓度的处理液，每个浓度做4个重复．选20粒均匀饱满的受体种子置培养皿中，盖上培养皿盖，放入设置温度为25 ℃，湿度为80%～90%的人工气候箱中培养7d，每天光照10 h左右，7 d后测量稗草和水稻幼苗的根长及苗高．按照Wiliamson提供的方法计算化感作用效应指数(Response Indices，RI)[8]．

其中，C为对照值，T为处理值．当RI>0时为促进作用，RI<0为抑制作用，RI绝对值大小与作用强度一致．用邓肯氏新复极差检验法(DMRT法)检验不同处理的差异显著性(α=0.05).

1.4 红汁乳菇菌丝体无水乙醇粗提物的GC-MS分析

采用DB-5柱(30 m×0.32 mm)色谱柱．柱子的初始温度为50 ℃，保留2 min，采用程序升温，升温速率为5 ℃/min，升至250 ℃，保留10 min后，继续以速率5 ℃/min升温至270 ℃，保留10 min．进样口的温度：240 ℃；进样量：1 μL；载气为He；流量：1 mL/min．电子轰击源，轰击电压为70 eV，扫描范围M/Z35～350 AMU，扫描速度0.2 s扫全程，离子源温度200 ℃．通过计算机检索系统，进行未知物的鉴定．

2 结果与分析

2.1 红汁乳菇菌丝体无水乙醇抽提物对稗草、水稻幼苗生长的影响

用无水乙醇抽提红汁乳菇菌丝体，抽提液配成0.875，1.75，3.5，7 g/L不同质量浓度后，抽提液由淡黄色逐渐变棕黄色,同时测定抽提液对稗草、水稻幼苗生长的影响．结果显示(见表1)：不同质量浓度的无水乙醇菌丝抽提液对稗草和水稻幼苗的生长均有一定程度的影响，且对稗草幼苗生长的影响比对水稻幼苗生长的影响大；随着质量浓度的增加，抽提液对稗草和水稻的幼苗生长的抑制作用也加强．质量浓度为0.875 g/L时，对稗草苗高和根长的抑制作用分别为-0.019 3、-0.078 4，在P=0.05水平上与对照差异不显著．质量浓度为1.75 g/L时，抽提液对稗草苗高和根长的抑制作用分别是-0.233 5、-0.355 4，与对照相比差异显著；对水稻幼苗的苗高和根长的促进作用达到最大，化感效应分别为0.308 1、0.306 3, 在P=0.05水平上与对照差异显著; 质量浓度为7 g/L时，对稗草和水稻的抑制作用均达到最大，对稗草苗高和根长的化感效应分别为-0.787 7和-0.711 3；对水稻苗高和根长的化感效应分别为-0.414 7和-0.498 6．

这一结果说明，红汁乳菇菌丝体乙醇抽提液对稗草有很强的抑制作用，且随着质量浓度的升高抑制作用增强；而对水稻表现出低质量浓度促进，高质量浓度抑制的效果．

表1 菌丝体抽提液对稗草、水稻幼苗生长的影响

注：RI为同一处理4次重复化感作用效应的平均值；表内标相同小写字母者,表示Duncan’s新复极差检验在P=0.05水平上,差异不显著.

2.2 红汁乳菇菌丝体无水乙醇抽提物的GC-MS鉴定

红汁乳菇菌丝体的无水乙醇抽提液样品的GC-MS总离子流图TIC见图1，应用HPCHEM质谱数据库，分析质谱图，确定各组分物质名称，其鉴定结果见表2．

表中所列出的化合物均属GC-MS鉴定在附和系数超过50%以上的化合物，不包括更多的含量低的未被鉴定出的化合物．对于那些弱峰，GC-MS鉴定出的化合物的可信度低，没有列入表2中．

图1 菌丝抽提液的GC-MS总离子流TIC图

化合物名称(中文)化合物名称(英文)壬酸Nonanoic acid十八烷酸Octadecanoic acid十四烷酸Tetradecanoic acid双(2-甲基丙基)酯-1,2-邻苯二甲酸1,2-Benzenedicarboxylic acid, bis(2-methylpropyl) estern-十六烷酸n-Hexadecanoic acid2-十四烷酮2-Tetradecanone6,10,14-三甲基-2-十五烷酮2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl-十六烷酸甲酯Hexadecanoic acid, methyl ester邻苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalate1,2-邻苯二甲酸二丁酯1,2-Benzenedicarboxylic acid, dibutyl ester十六烷酸乙酯Hexadecanoic acid, ethyl ester十八烷酸乙酯Octadecanoic acid, ethyl ester3,7,11,15-四甲基[R-[R*,R*-(E)]] 2-十六烷烯-1-醇2-hexadecene-1-oL,3,7,11,15-tetramethyl-, [R-[R*,R*-(E)]]-3-(1',3'-丁间二烯基)-吲哚3-(1',3'-Buta-dienyl)-indole

由GC-MS测定分析结果显示：红汁乳菇菌丝体无水乙醇抽提液中含有低分子量的脂肪酸、有机酸、酮、酯、醇、吲哚、烃、酚类等化合物，其中有一些物质属于陈秋波和韩丽梅等人归纳的具有化感作用的物质[9-10]，如菌丝中含有的吲哚类衍生物——3-(1′,3′-丁间二烯基)-吲哚、邻苯二甲酸、邻苯二甲酸二丁酯，苯酚类化合物等．

3 结果与讨论

红汁乳菇菌丝体无水乙醇抽提液对稗草抑制作用较大，且随着质量浓度的升高，抑制作用增强．当质量浓度为7 g/L时，对稗草的苗长和根长的抑制作用分别达到78.77%和71.13%；而对水稻表现出低质量浓度促进根的生长，高质量浓度抑制幼苗生长的效果．当质量浓度为1.75 g/L时，粗提物对水稻苗高和根长的促进作用分别为0.308 1和0.306 3，而在此质量浓度下，对稗草的抑制作用明显，因此可利用此特性，将菌丝体无水乙醇粗提物开发成稻田除草剂．

菌丝中含有的邻苯二甲酸和邻苯二甲酸二丁酯，曾被报导具有很强的化感作用．周志红等人研究番茄植株中几种化学成分的化感作用，结果显示：从番茄植物中提取的邻苯二甲酸二丁酯对生菜、白菜和萝卜均有抑制作用[11]．韩丽梅等人(2003)研究大豆根分泌物对大豆幼苗生长的影响，结果也表明:在一定浓度范围内, 邻苯二甲酸对大豆幼苗生长具有显著的化感抑制作用[12]．从报道来看，红汁乳菇菌丝体乙醇抽提物的化感作用很有可能由邻苯二甲酸和邻苯二甲酸二丁酯等有机酸类化感物质产生的．

参考文献：

[1] RICE E L. Allelopathy[M]. New York: Academic Press, 1974.

[2] CUTLER H G. Biologically active natural products from fungi:Templates for tomorrow’s pesticides[J]. American Chemical Society Ser, 1984, 257:153-170.

[3] DUKE S O. Microbically produced phytotoxins as herbicides a perspective[C]// PUTNAM A R, TANG C S. The Science of Allelopathy. New York: John Wiley & Sons, 1986, 287-304.

[4] SEGULA M. Isolation and characterization of a novel atrazine metabolite produced by the fungus[J]. Pulmonarius of Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(12):4 342-4 346.

[5] VENKATASUBBAIAH P. Phytotoxic metabolites of phomasorghina[J]. Mycologia, 1995, 84:715.

[6] 莫美华, 马红梅, 肖启福, 等. 红汁乳菇醇提物对水稻、稗草的化感影响[J]. 生态学报，2004，24(12)：2 951-2 954.

[7] LIU J C, CHEN X Y, LI W Y. Study of the distribution and ecological environment of Lacterius hatsudake Tanaka in west Hunan[J]. Edible Fungi of China, 1995,14(6):36-37.

[8] WILLAMSON G B. Bioassays for allelopathy: measuring treatment responses with independent control[J]. J of Chem Ecol, 1988,14(1): 181-187.

[9] 陈秋波， 彭黎旭， 贺利民， 等. 刚果12号桉树根及根际土壤中化感物质的成分分析[J].热带农业科学，2002，22(4)：28-34.

[10] 韩丽梅， 阎 飞， 王树起， 等. 重迎茬大豆根际土壤有机化合物的初步鉴定及对大豆种子萌发的化感作用[J]. 应用生态学报，2000，11(4)：582-586.

[11] 周志红, 骆世明, 牟子平. 番茄植株中几种化学成分的化感效应[J]. 华南农业大学学报,1998,19(3): 56-60.

[12] 韩丽梅, 王树起, 鞠会艳，等. 吸附树脂提取的大豆根分泌物种类的GC-MS[J]. 大豆科学, 2003,22(4): 302-305.