双平板对照筛选跟踪分离细菌外排泵抑制剂

杨再昌,杨小生,牛玉乐

1贵州大学化工学院,贵阳 550003;2贵州省、中国科学院天然产物化学重点实验室,贵阳 550004

双平板对照筛选跟踪分离细菌外排泵抑制剂

杨再昌1＊,杨小生2,牛玉乐1

1贵州大学化工学院,贵阳 550003;2贵州省、中国科学院天然产物化学重点实验室,贵阳 550004

建立了细菌外排泵抑制剂的筛选与活性跟踪方法。准备 2个平板,一个为普通营养琼脂平板,另一个为含小蘖碱的普通营养琼脂平板,通过比较两个平板含药纸片周围抑菌圈的直径大小判断筛选结果,方法可靠稳定。筛选发现某霉菌提取物对细菌外排泵有抑制活性,经活性跟踪分离,得到单体化合物,经 NMR鉴定为 4′, 5,7-三羟基异黄酮。方法简便易行,成本低,适宜于对大批样本进行快速筛选并在分离时进行活性跟踪。

筛选;细菌外排泵;抑制剂;双平板

细菌外排泵 (Bacterial efflux pump)是细菌将胞内毒物运输到胞外环境的蛋白质。细菌基因组学的研究表明,5%～10%的基因与细菌的物质运输有关,这部分基因主要编码外排泵,使细菌能在不利的环境中生存下来。几乎所有抗生素对细菌来说都是有毒性的,因此抗生素很容易诱导细菌外排泵的超表达,并可导致交叉耐药,使细菌获得泵出多种抗菌药物的能力。另外,超表达外排泵的菌株,还容易导致其它抗菌药物作用靶点的变异。由此可见,外排泵在细菌耐药性形成的过程中扮演着重要角色[1]。

近年来的研究表明,外排泵被抑制后,细菌可重新恢复对抗菌药物的敏感性,为研制抗耐药菌药物提供了新的思路。由于大多数外排泵在结构上具有高度的同源性,使发现对多种外排泵均有抑制活性的广谱抑制剂成为可能,外排泵抑制剂与抗生素组合,将提高或恢复抗生素的抗菌活性[2]。外排泵是跨膜蛋白的一种,依赖质子势能提供能量,以离体外排泵蛋白为靶点较难实现高通量筛选,基于细胞的筛选方法被广泛使用。一种方法是用同位素标记外排泵底物(如四环素),通过测定细菌胞内药物浓度评价抑制剂的活性;另一方法是构建外排泵超表达菌株,通过测定M I C评价抑制剂的活性[3]。这两种方法对实验条件要求较高,有一定技术难度。

本实验将铜绿假单胞菌 (ATCC 27853)在亚抑菌浓度的小蘖碱琼脂平板中不断传代,经利血平、小蘖碱联合抗菌试验证明,该菌株对小蘖碱的耐药性进一步增强。以小蘖碱为该菌株的外排泵底物,建立了筛选细菌外排泵抑制剂的双平板对照法筛选模型,并采用本法进行活性跟踪,从微生物发酵产物中分离到活性单体,经NMR鉴定为 4′,5,7-三羟基异黄酮(Genistein),经荧光分光光度法测定细菌胞内外排泵底物小蘖碱的浓度,进一步验证该单体有抑制细菌外排泵的作用。

1 材料

铜绿假单胞菌为 ATCC 27853标准菌株,由贵州省、中科院天然产物化学重点实验室赠送,小蘖碱、利血平为 Sigma公司产品,蛋白胨、牛肉浸膏、琼脂粉为北京双旋微生物培养基制品厂产品。荧光分光光度计为岛津 RF-540。

2 方法

2.1 用小蘖碱诱导铜绿假单胞菌耐药

按常规方法制小蘖碱含量分别为 350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000μg/mL的营养琼脂平板,首先划线接种铜绿假单胞菌于 350μg/mL的营养琼脂平板上,37℃培养24 h后,钓取生长旺盛的菌落,从低浓度到高浓度,依次接种培养,传 14代后,菌株用小蘖碱含量为1000μg/mL的营养琼脂平板维持培养备用。

2.2 细菌外排泵抑制剂的双平板对照筛选法

铜绿假单胞菌经诱导后在含小蘖碱的营养琼脂平板中生长良好,接种细菌后,在琼脂表面贴上纸片,再滴加待筛选的样本溶液,如果样本对外排泵有抑制作用,则细菌不能外排小蘖碱,小蘖碱在细菌胞内发挥抗菌作用,致纸片周围形成抑菌圈。因样本本身也可能具有抑菌作用,还需检测样本对不含小蘖碱的营养琼脂平板上的相同细菌是否具有抑制作用,不含小蘖碱的平板叫对照平板。如果样本使含小蘖碱平板的纸片周围形成抑菌圈,而在对照平板的纸片周围无抑菌圈,样本很可能对外排泵有抑制作用,反之,如果一个样本在两种平板上都形成抑菌圈,这个样本应与外排泵抑制作用无关,这个方法即双平板对照法。具体做法见图 1,准备 2个 90 mm的培养皿制备琼脂平板,一个平板为含小蘖碱 256 μg/mL的营养琼脂平板 (A),另一个为普通营养琼脂平板(B),样本用少量甲醇溶解后,用 PBS液(0.2 mol/L,pH 7.2)稀释成 5 mg/mL的溶液。在平板接种菌液后(105 CFU/mL),贴上纸片,每纸片加 5μL的样本溶液,纸片载药量为 25μg,37℃培养 18 h后观察结果,记录抑菌圈直径 (包括纸片直径)。用利血平(1号纸片,一种已知细菌外排泵抑制剂,0.5 mg/mL)作阳性对照。一次可筛选 3个样本。

2.3 活性单体的跟踪分离及结构鉴定

采用双平板对照筛选法发现某霉菌发酵液能抑制铜绿假单胞菌外排泵,扩大培养得发酵液 5000 mL,减压浓缩后,分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得 3个提取部位,活性跟踪发现乙酸乙酯部位活性最强,用硅胶柱分离,用石油醚/乙酸乙酯 (3∶1)洗脱,收集得 30份洗脱液,其中第 18至第 20份均有活性,合并后再经硅胶柱分离,得到浅灰色粉末。测定化合物理化性质,用NMR进行结构鉴定。

2.4 细菌胞内小蘖碱浓度的测定

小蘖碱(Berberine)属异喹啉类生物碱,进入细菌胞内后,与细菌的DNA分子结合,荧光增强,进入胞内的小蘖碱越多,发出的荧光越强,因此,测定荧光强度可以间接反映细菌胞内小蘖碱的量。测定按文献方法进行[4],即用MH肉汤培养铜绿假单胞菌致A600为 1.8,菌液离心,弃去上清液,沉淀用 20 mmol/L的 HEPES/NaOH(pH 7.0)缓冲液洗涤 3次,菌液用含葡萄糖 10μmol/L的 HEPES缓冲液调整致A600为 0.3,37℃培养1 h,离心,用HEPES缓冲液洗涤后调整致A600为 0.15。取菌液 3 mL,加入小蘖碱溶液 0.5 mL(120μg/mL)及活性单体化合物溶液 0.5 mL(配成 64、128、256μg/mL三个浓度,每一浓度做 2管),对照管只加小蘖碱及HEPES/NaOH(pH 7.0)缓冲液,在 0、5、10、15、20、25、30 min时段内,分别在激发光波长 355 nm、发射光波长 517 nm的条件下用荧光分光光度计测定荧光强度。

3 结果

铜绿假单胞菌ATCC 27853一般作为药敏试验的质控菌株,小蘖碱对该菌株的M I C为512μg/mL,经小蘖碱诱导后,小蘖碱抑制该菌株的M IC>1000 μg/mL,在 1/4 M I C的小蘖碱营养琼脂平板中,该菌株生长良好,其菌落生长情况与不含小蘖碱的营养琼脂平板的情况无差异。当小蘖碱浓度提高到1000μg/mL时,该菌株虽然未能被杀死,但菌落变小,生长不良。

双平板对照筛选法显示(图 1),利血平 (1号纸片)在不含小蘖碱的营养琼脂平板 (B)中对无铜绿假单胞菌无抑制作用,在 1/4 M I C的小蘖碱营养琼脂平板 (A)中能形成明显的抑菌圈 (直径 10.4 mm),说明利血平本身对该菌株无抗菌活性,但通过抑制细菌外排泵,提高了该菌株对小蘖碱的敏感性;编号为 2的样本,在 A、B平板中均无抑菌圈,表明该样本本身无抗菌活性,也不是外排泵抑制剂;编号为 3的样本,在A、B平板中均形成抑菌圈,表明该样本本身具有抗菌活性,不一定是细菌外排泵抑制剂;编号为 4的样本,抑菌圈直径 13 mm,和利血平结果一致,是细菌外排泵抑制剂。

图 1 双平板筛选细菌外排泵抑制剂Fig.1 Screening for bacterial efflux pump inhibitors by double plates

活性单体化合物(4号样品)在甲醇中重结晶得针状晶体,难溶于水,能溶于丙酮、乙醇、DMSO、甲醇等有机溶剂,熔点 297℃。1H NMR(Acetone)δ: 13.05(1H,s),9.71(1H,s),8.19(1H,s),8.55 (1H,s),7.46(2H,d,J=6.4 Hz),6.92(2H,d,J= 6.8 Hz),6.43(1H,d,J=2.4 Hz),6.28(1H,d,J= 2.4 Hz)。13C NMR(Acetone)δ:154.3(C-2),123.0 (C-3),181.6(C-4),159.0(C-5),99.8(C-6), 164.9(C-7),94.4(C-8),158.4(C-9),106.1(C-10),123.9(C-1′),131.1(C-2′,6′),115.9(C-3′, 5′),163.9(C-4′)。结合文献[5],该化合物鉴定为4′,5,7-三羟基异黄酮 (4′,5,7-trihydroxyisoflavone),即金雀异黄酮(Genistein),结构见图 2。

图 2 4′,5,7-三羟基异黄酮Fig.2 4′,5,7-Trihydroxyisoflavone

4′,5,7-三羟基异黄酮能抑制细菌外排泵,提高细菌胞内小蘖碱的量,结果见图 3。加入小蘖碱后,菌液相对荧光强度逐渐上升,4′,5,7-三羟基异黄酮在低浓度(64μg/mL)时对细菌外排泵已经具有明显的抑制作用,增大浓度后,相对荧光单位进一步提高,存在明显的量效关系。

图 3 菌液相对荧光强度曲线Fig.3 Relative fluorescence units of cell

4 讨论

近年来随着对细菌耐药机制研究的不断深入,认识到细菌外排泵的超表达是耐药性形成的主要原因之一,筛选发现新的细菌外排泵抑制剂 (EPIs,Efflux Pump Inhibitors)成为抗菌药物研究的热点。第一个被发现的 EPIs是来源于植物的生物碱利血平,因用量大时有神经毒性,故未能与抗菌药物组成复合制剂,以后又从植物提取物中分离到一些 EPIs单体化合物,有的已经进入临床试验阶段。在生态的选择压力下,植物可产生一些天然小分子对抗细菌外排泵,从植物中发现新的 EPIs的机会很大[6]。

为了对中药提取物进行普筛,在吸取前人方法的基础上,我们建立了双平板对照筛选法,本法采用小蘖碱作为细菌外排泵底物,通过比较两个平板含药纸片周围有无抑菌圈及抑菌圈的直径大小,判断筛选结果。方法简便易行,成本低,适宜于对大批样本进行快速筛选并在分离时进行活性跟踪。

筛选发现某霉菌的提取物能抑制铜绿假单胞菌对小蘖碱的外排作用,经活性跟踪分离、NMR鉴定,活性单体为 4′,5,7-三羟基异黄酮,实验结果表明,该化合物提高了细菌细胞内小蘖碱的荧光强度。4′,5,7-三羟基异黄酮有多种生物学活性,同时也是肿瘤细胞 P-糖蛋白抑制剂,P-糖蛋白是肿瘤细胞的外排泵[7],可见该化合物是一种广谱 EPIs。对 4′, 5,7-三羟基异黄酮进行结构改造,以提高抑制细菌外排泵的专属性的研究工作正在进行之中。

1 WebberMA,Piddock LJV.The importance of efflux pumps in bacterial antibiotic resistance.Journal of Antinicrobial Chemotherapy,2003,51:9-11.

2 Lomovskaya O,Warren M,Lee A,et al.Identification and characterization of inhibitors of multidrug resistance efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa:novel agents for combination therapy.Ant im icrobial Agent and Chemotherapy,2001, 45:105-116.

3 StavriM,Piddock LJ,Gibbons S.Bacterial efflux pump inhibitors from natural sources.Journal of Antim icrobial Chemotherapy,2007,59:1247-1260.

4 Tegos G,Ster mitz FR,Lomovskaya O,et al.Multidrug pump inhibitors uncover remarkable activity of plant ant imicrobials.Antim icrobial Agent and Chem otherapy,2002,46:3133-3141.

5 Kozerski L,Kamien ski B,Kawe cki R,et al.Solution and solid state 13C NMR and X-ray studies of genistein complexeswith amines.Potential biological function of the C-7,C-5,and C-4-OH groups.O rg B iomol Chem,2003,1:3578-3585.

6 Markham PN.Inhibition of the emergence of ciprofloxacin resistance in Streptococcus pneumonide by the multidrug efflux inhibitor reserpine.Antim icrob Agents Chem other,1999,43: 988-989.

7 Castroa AF,Altenberg GA.Inhibition of drug transport by Genistein in multidrug-resistant cells expressing P-glycoprotein.B iochem ical Phar m acology,1997,53:89-93.

Screen ing for and Bioassay-guided Isolation of Bacterial Efflux Pump Inhibitors by ControlM ethod Based on Double Plates

YANG Zai-chang1＊,YANG Xiao-sheng2,N IU Yu-le11Chem ical Engineering College of Guizhou University,Guiyang 550003,China;2Key Laboratory of Chem istry forNatural Products of Guizhou Province and Chinese Academ y of Sciences,Guiyang 550004,China

To establish the method of screening for and bioassay-guided isolation of bacterial efflux pump inhibitors.Two plateswere prepared.One was nutrient agar plate and anotherwas also nutrient agar plate but contained berberine.The determination of the screening resultswasmade by the measurements of the diameters of the inhibition zone around the discs that to be pasted on the surface of the two plates and contained test samples.The method was reliable and steady. The extractof one kind of themould showed the activity to inhibit bacterial effluxpump.A monomeric compoundwaspurified by bioassay-guided isolation and identified as 4′,5,7-trihydroxyisoflavone by 1H and 13C ofNMR.The screening method for bacterial effluxpump inhibitorswas very simple and cheap forpractice.It is suitable forwho wanted to screen for bacterial efflux pump inhibitors from large quantities of samples.Also it is a good bioassay in isolation.

screening;bacterial efflux pump;inhibitors;double plates

1001-6880(2010)02-0277-04

2008-07-16 接受日期:2008-12-11

贵州大学博士启动基金(No.X065008)

＊通讯作者 Tel:86-851-6848659;E-mail:yangzaichang@126.com

R285.5;Q58

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