盾叶薯蓣内生真菌Dzf13抗细菌活性成分

蔡晓月,李培琴,单体江,徐利剑,胥 岩,周立刚

中国农业大学农学与生物技术学院,北京 100193

盾叶薯蓣内生真菌Dzf13抗细菌活性成分

蔡晓月,李培琴,单体江,徐利剑,胥 岩,周立刚＊

中国农业大学农学与生物技术学院,北京 100193

采用活性追踪分离的方法,从盾叶薯蓣内生真菌菌株 Dzf13中分离到两个具抗细菌活性的化合物 1和2,经理化和波谱分析鉴定为麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇 (1)和 5α,8α-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇 (2)。结果表明,化合物 1和 2对根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌和番茄疮痂病菌等三种植物病原细菌的生长均表现出一定的抑制活性,尤其对黄瓜角斑病菌的抑制活性较强。结果还表明 5α,8α-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇 (2)的抗细菌活性要比麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(1)强。

盾叶薯蓣;内生真菌Dzf13;抗细菌活性成分;抗细菌活性

植物内生真菌 (Plant endophytic fungi)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织或器官内部,其宿主植物不表现出外在病害症状的真菌[1,2]。大量研究结果表明,几乎所有植物中都有内生菌的存在,由于长期的协同进化,这些内生菌与宿主植物形成了互惠共生的关系[3,4]。植物内生菌能产生多种次生代谢产物,具有促进植物生长、提高宿主植物抗性等生理生态功能,其中内生菌普遍存在着抗菌活性[2,5-8]。由于研究内生真菌中抗菌活性物质具有十分重要的理论意义和广阔的应用前景,近年来这方面的进展十分迅速,尤其是从内生真菌中筛选到许多具有抗菌活性的化合物[2,6,7]。采用 TLC-自显影并结合各种色谱方法能有效地从内生真菌提取物中获得抗菌活性成分[9]。

盾叶薯蓣 (D ioscorea zingiberensisC.H.W right)为薯蓣科 (Dioscoreaceae)薯蓣属多年生药用植物,主要分布在中国的陕西、江西、湖北、湖南、四川等地,以根状茎入药[10]。本研究小组已对盾叶薯蓣内生真菌及其抗菌活性进行了研究,发现许多内生真菌具有抗菌活性[11-16]。尚未见盾叶薯蓣内生真菌甾体类抗菌化合物的研究报道。本研究从盾叶薯蓣内生真菌菌株Dzf13中追踪分离具抗菌活性的甾体化合物并对其抗细菌活性进行评价,以便将来有效地利用内生真菌中的抗菌活性成分。

1 材料与方法

1.1 内生真菌

内生真菌菌株Dzf13于 2005年从野生健康的 5年生盾叶薯蓣 (D ioscorea zingiberensisC.H.W right)根状茎中分离得到,盾叶薯蓣根状茎采自陕西,由武汉大学李家儒教授鉴定。内生真菌Dzf13的形态特征为:菌落致密,白色,凸起,菌丝短绒毛状,生长缓慢,菌落背面灰色,未见产孢。通过 rDNA分子鉴定,其 ITS序列与管兰伯盘菌 (Lam bertella tubulosa)的 ITS序列相似度为 97.0%,提交 Dzf13序列到GenBank核酸序列库中获得序列号为 EU543256[11]。Dzf13菌种现保存在中国农业大学植物病理学系。

1.2 仪器与试剂

XT4-100显微熔点仪 (北京科仪电光仪器厂),温度计未校正;Bruker Avance DPX 300型核磁共振仪,CDCl3为溶剂,T MS为内标;RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);VSP-3050型中压液相色谱仪(东京理化器械株式会社);Bio-Rad 550型多孔板分光光度计。

柱层析硅胶(200±300目)和薄层硅胶板(青岛海洋化工有限公司);Sephadex LH-20和反相硅胶RP-18(Pharmacia公司);噻唑蓝 (MTT,美国 Amresco公司);硫酸链霉素 (Serva公司);其他试剂均为分析纯。

1.3 化合物分离与纯化

1000 mL体积的三角瓶中盛 300 mL马铃薯-葡萄糖液体培养基 (PDB),将预先培养好的 Dzf13菌丝接种到已灭菌的培养基中,在 25℃、150 r/min下暗培养 14 d,得总发酵液 50 L,过滤得菌丝和菌液。菌液减压浓缩,依次用等体积的石油醚 (重复 3次)和正丁醇(重复 3次)萃取;菌丝阴干后用丙酮提取3次,浓缩后用水混悬,依次用等体积的石油醚 (重复 3次)和正丁醇 (重复 3次)萃取。通过 TLC检测,菌丝和菌液中石油醚萃取部分所含成分一致,合并后减压浓缩得石油醚萃取物 21 g;菌丝和菌液中正丁醇萃取部分所含成分一致,合并后减压浓缩得正丁醇萃取物 15 g。经 TLC-生物自显影检测[9],石油醚部分和正丁醇部分均含有抗菌活性成分。

石油醚部分经正相硅胶柱层析(石油醚-丙酮梯度洗脱:1:0⇀0:1,v/v)、Sephadex LH-20凝胶柱层析和重结晶,得化合物 1(15 mg);正丁醇部分经正相硅胶柱层析 (氯仿-甲醇梯度洗脱:10:1⇀1:10, v/v)、SephadexLH-20凝胶柱层析、反相硅胶柱层析和重结晶,得化合物 2(35 mg)。经理化和波谱分析并与文献对照,化合物 1和 2分别鉴定为麦角甾-5, 7,22-三烯-3β-醇[18]和 5α,8α-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇[19]。

1.4 供试细菌及其培养

供试细菌有:根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tum efaciens;缩写为 A.t.)、黄瓜角斑病菌 (Pseudom onas lachrym ans;缩写为 P.l.)和番茄疮痂病菌(Xanthom onas vesicatoria;缩写为 X.v.),由中国农业大学植物病理学系提供。上述供试的植物病原细菌菌株长期保存在-20°C下,在抗菌活性测定前,需要进行菌种活化。供试细菌在LB(酵母浸膏5 g/L、蛋白胨 10 g/L、氯化钠 5 g/L;pH 7.0)平板上进行活化培养(28°C,暗)48 h,然后挑取单菌落,在 LB液体培养基中摇培 (28°C,暗,150 r/min)24 h,然后用血球计数板将菌液浓度调到 108 cfu/mL,即可用于活性测定。

1.5 抗细菌活性测定

采用多孔板-MTT显色法测定化合物对细菌的最低抑制浓度 (M IC)值[16]。具体步骤如下:在洁净无菌的 96孔培养板中加入浓度为 106cfu/mL的供试菌液 90μL,然后加入不同浓度梯度的化合物母液 10μL,溶剂(丙酮)终浓度为 10.0%。同时设阳性对照、空白对照和溶剂对照,每个处理 6个重复。将 96孔板于 28℃下,振荡(15 r/min)、暗培养 24 h后每孔中加入MTT溶液 (5 mg/mL)10μL,继续培养 4 h后,在 1500 g下离心 20 min,去上清,每孔加入DMSO 150μL,振荡(15 r/min)30 min,以终止反应并助其溶解。肉眼即可观察判断化合物的M I C值,即培养基中刚好无蓝色物质生成的药剂浓度。为了进一步验证M IC值,从多孔板每个孔中吸取 10 μL培养液涂布到 LB平板上,在 28℃下培养 24 h后观察统计平板菌落数。

采用多孔板-MTT-分光光度法测定化合物对细菌的半抑制浓度 (IC50)值[17]。具体步骤如下:加入DMSO终止反应之前的步骤同于M I C值的测定。将显色的菌悬液在 1500 g下离心 20 min,将上清(100 μL DMSO)转移至另一干净的 96孔板中,采用多孔板分光光度计测定 590 nm处的光吸收值,计算出抑制率(%)。再根据抑制率,查几率值表,可得抑制率机率值 (y),将化合物浓度 (μg/mL)换算成浓度对数(x),即可求出线性方程 y=ax+b,根据线性方程可求出半抑制浓度 (IC50)。

2 结果与分析

通过多孔板-MTT显色法测定化合物对细菌的M IC,并采用多孔板-MTT-分光光度法测定化合物对细菌的 IC50,结果(表 1)表明,麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(1)和 5α,8α-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(2)对三种供试植物病原细菌均表现出一定的抑制活性,尤其是对黄瓜角斑病菌的抗性比较强。同时, 5α,8α-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(2)的抗细菌活性要比麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(1)强。

表 1 麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇和 5α,8α-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇对细菌的抑制活性Table 1 Inhibitory activity of ergosta-5,7,22-trien-3β-ol and 5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol on bacteria

3 讨论

从 TLC-自显影结果看,麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(1)和 5α,8α-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(2)是内生真菌Dzf13中的两个主要抗菌活性成分,但还有其他抗细菌活性成分 (极性大的部分)未被分离出来,值得进一步研究。5α,8α-过氧麦角甾-6, 22-二烯-3β-醇 (2)较麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇 (1)具有更强的抗细菌活性,这可能与其含有的过氧基团有关。Li等从狗牙根 (Cynodon dactylon)内生曲霉 (Aspergillussp.)CY725中也分离到化合物 1和2,它们对幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori)均具有很好的抑制活性[20]。随后,Dai等从加拿利刺柏 (Juniperus cedre)的内生真菌 N odulisporium sp.中也分离到上述两甾体成分,但未报道它们的抗细菌活性[8]。内生真菌 Dzf13存在于盾叶薯蓣体内,产生抗菌活性成分的生理生态功能值得深入研究。本研究结果将为利用盾叶薯蓣内生真菌Dzf13生产抗菌活性成分提供依据。

致谢:武汉大学李家儒教授和湖北大学陈永勤教授提供盾叶薯蓣材料,中国农业大学理学院王明安教授在化合物结构解析方面给予支持,在此表示感谢。

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Antibacterial Compounds from the Endophytic Fungal Isolate Dzf13 Associated withD ioscorea zingiberensis

CA IXiao-yue,L I Pei-qin,SHAN Ti-jiang,XU Li-jian,XU Yan,ZHOU Li-gang＊
College of Agronomy and B iotechnology,China AgriculturalUniversity,Beijing 100193,China

Two antibacterial compounds,ergosta-5,7,22-trien-3β-ol and 5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol,were isolated and identified by bioassay-guided fractionation from the extract of the endophytic fungal isolate Dzf13 from the rhizomes ofD ioscorea zingiberensis,a dioscoreaceousmedicinalplant.Both two compoundswere screened and have inhibitory activity on plant pathogenic bacteria such as Agrobacterium tumefaciens,Pseudomonas lachrymans and Xanthomonas vesicatoria by using themicroplate-MTT colorimetric assay.Of three bacterialpathogens,P.lacrymanswasmost effectively inhibited.In addition,5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-olwas found to be more bioactive than ergosta-5, 7,22-trien-3β-ol.

D ioscorea zingiberensis;endophytic fungal isolate Dzf13;antibacterial compounds;antibacterial activity

1001-6880(2010)02-0274-04

2009-08-03 接受日期:2009-11-24

北京市自然科学基金 (6092015);国家自然科学基金(30871662)

＊通讯作者 Tel:86-10-62731199;E-mail:lgzhou@cau.edu.cn

Q939.92

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