棕榈酸对胰岛β细胞激素敏感性脂肪酶的影响

王咏波 陈璐璐 田源 李燕

棕榈酸对胰岛β细胞激素敏感性脂肪酶的影响

王咏波 陈璐璐 田源 李燕

长期的高脂会造成胰岛β细胞胰岛素分泌障碍和三酰甘油(TG)的堆积，而过度堆积的TG是脂毒性的重要表现。

激素敏感性脂肪酶(HSL)是催化TG水解的限速酶，在胰岛β细胞内表达和活化，并可能与胰岛素分泌及β细胞TG堆积有关。但是高脂对HSL的影响并不十分清楚。因此，本实验以不同浓度棕榈酸培养胰岛β细胞，观察其HSL的变化。

一、材料和方法

1．细胞培养：NIT-1细胞株(来源于转基因小鼠的胰岛β细胞系)购于华中科技大学同济医学院免疫学系，常规培养传代。取对数生长期的NIT-1细胞，按1.0 ×106个/ml接种于6孔培养板中培养24 h,换含不同浓度棕榈酸(0、0.125、0.25、0.5 mmol/L)的2%胎牛血清的DMEM培养液继续培养24、48和72 h。每种浓度、每个时间点均设3个复孔。

2．胰岛细胞TG含量测定：细胞用预冷的PBS洗涤、离心后置氯仿/甲醇 (2∶1 vol/vol)4℃过夜，3000 r/min离心15 min，弃上清后干燥，再溶于异丙醇,测定TG 含量。

3．HSL活性测定：将细胞分别加入含或不含10-5mol/L的异丙肾上腺素的PBS液中，置37℃温浴1 h，3000 r/min离心15 min，取上清测定甘油的含量，它代表HSL的活性。甘油的测定按照试剂盒(Rochester公司)说明书操作。

4. HSL mRNA检测：采用RT-PCR方法。用Trizol试剂(Invitrogen 公司)提取细胞总RNA。HSL引物上游5′-GGCTGGAACCAACCCTAG-3′,下游5′-AGTCCTTCATCACCCTCGA-3′，扩增产物306 bp；内参β-actin引物上游5′-CTGGCACCACACCTTCTACA-3′，下游5′-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3′，扩增产物758 bp，由上海博亚基因技术有限公司合成。cDNA合成反应为42℃ 1 h；PCR反应：94℃ 5 min，94℃ 60 s、50℃ 90 s、72℃ 60 s,36个循环，最后72℃延伸5 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后扫描分析。

5．HSL蛋白检测：采用Western blotting方法。收集培养的各组细胞,加入裂解缓冲液裂解细胞, 4℃离心,取上清，测蛋白浓度。取50 μg蛋白质行Western blotting。用Labworks图像分析系统扫描,以光密度值计算蛋白表达量。

二、结果

1．棕榈酸对NIT-1细胞内TG含量的影响：0、0.125、0.25和0.5 mmol/L棕榈酸干预24 h后，TG含量分别为(3.25±0.42)pmol/106cell、(3.74±0.44)pmol/106cell、(4.35±0.58)pmol/106cell和(5.76±0.51)pmol/106cell；48 h后为(3.52±0.37)pmol/106cell、(4.03±0.55)pmol/106cell、(5.11±0.59)pmol/106cell和(6.54±0.47)pmol/106cell。

0.125 mmol/L组干预后48 h以及0.25 mmol/L和0.5 mmol/L组干预后24 h均较不加棕榈酸组明显增加(P<0.05)。

2．棕榈酸对NIT-1细胞HSL mRNA和蛋白表达的影响：干预24 h时NIT-1细胞内HSL mRNA和蛋白的表达随着棕榈酸浓度的增加而逐渐增加；干预48 h时0.25 mmol/L组HSL mRNA和蛋白的表达量最高(图1、2)。

图1 棕榈酸干预NIT-1细胞24(a)、48 h(b)时HSL mRNA的表达

图2棕榈酸干预NIT-1细胞24(a)、48 h(b)细胞HSL蛋白表达

讨论游离脂肪酸(FFA)作为胰岛素分泌的信号分子，短时间内(<3～6 h)升高可促进基础和葡萄糖刺激后胰岛素分泌(GSIS)[1-2]，而长时间(>24 h)的高FFA则产生脂毒性，抑制GSIS，引起β细胞凋亡[3-6]。这主要是由饱和脂肪酸引起[7]。因此本实验采用体外棕榈酸(饱和脂肪酸)干预来研究高脂对胰岛细胞的HSL及脂质的影响。

Winzell等[8]报道，高脂喂养的小鼠，血浆FFA升高，胰岛TG堆积，胰岛素分泌障碍， HSL表达先升高后下降，说明了高脂对HSL的早期调节，也证实了脂毒性的存在。胰岛HSL表达的下调可能是机体为减少TG水解，减少脂肪酸的产生，减轻脂毒性，对脂肪酸介导的胰岛细胞功能障碍作出的自身保护性反应。Winzell等[9]采用HSL过表达转基因鼠来研究HSL与胰岛β细胞脂毒性的关系。与野生鼠相比，HSL过表达鼠在接受高脂饮食后，表现出胰岛细胞中TG含量减少，葡萄糖耐量异常，GSIS障碍。推测HSL过表达鼠在长期高脂饮食下不能适当地调节HSL，HSL持续刺激细胞内TG分解，加重了脂毒性。本实验结果显示，随着棕榈酸浓度增加和干预时间的延长，细胞内TG含量也呈现出增加趋势。同时，HSL mRNA 和蛋白的表达也增加，与Winzell等[8]的结果相似。

文献报道[10-11]，FFA促进HSL表达的同时却抑制了HSL的活性。本结果显示棕榈酸的干预对HSL活性并无影响。Hu等[12]认为，在相同条件下，FFA对脂肪组织脂解表现为抑制，而对胰岛细胞表现为促进。但他们强调了LC-CoA在胰岛素分泌中的重要作用，而忽略了细胞内长期高LC-CoA对胰岛细胞的毒性作用。本实验脂解没有明显增加可能正是长期高LC-CoA对胰岛细胞的毒性作用的表现，只是FFA对胰岛细胞脂解的抑制作用出现得更缓慢一些。

[1] Ayvaz G,Balos Törüner F，Karakoc A, et al . Acute and chronic effects of different concentrations of free fatty acids on the insulin secreting function of islets.Diabetes Metab,2002,28:3S12;discussion 3S108-3S112.

[2] Carpentier A,Mittelman SD,Lamarche B,et al.Acute enhancement of insulin secretion by FFA in humans is lost with prolonged FFA elevation.Am J Physiol,1999,276:E1055-E1066.

[3] Zhou YP,Grill VE.Long-term exposure of rat pancreatic islets to fatty acids inhibits glucose-induced insulin secretion and biosynthesis through a glucose fatty acid cycle.J Clin Invest,1994,93:870-876.

[4] Sako Y,Grill VE.A 48-hour lipid infusion in the rat time-dependently inhibits glucose-induced insulin secretion and B-cell oxidation through a process likely coupled to fatty acid oxidation.Endocrinology,1990,127:1580-1589.

[5] Elks ML.Chronic perifusion of rat islets with palmitate suppresses glucose stimulated insulin release.Endocrinology,1993,133:208-214.

[6] Bollheimer LC,Skelly RH,Chester MV,et al.Chronic exposure to free fatty acid reduces pancreatic beta-cell insulin content by increasing basal insulin secretion that is not compensated for by a corresponding increase in proinsulin biosynthesis translation.J Clin Invest,1998,101:1094-1101.

[7] Kathrin M,Jose O,Pascal B,et al.Monounsaturated fatty acids prevent the deleterious effects of palmitate and high glucose on human pancreatic B-cell turnover and function.Diabetes,2003,52:726-7331.

[8] Winzell MS,Holm C,Ahrén B.Downregulation of islet hormone-sensitive lipase during long-term high-fat feeding. Biochem Biophys Res Commun,2003,304:273-278.

[9] Winzell MS,Svensson H,Enerback S,et al.Pancreatic beta-cell lipotoxicity induced by overexpression of hormone-sensitive lipase.Diabetes,2003,52:2057-2065.

[10] Berraondo B,Martínez JA.Free Fatty Acids Are Involved in the inverse relationship between hormone-sensitive lipase(HSL) activity and expression in adipose tissue after high-fat feeding or beta-3 adrenergic stimulatio.Obes Res,2000,8:255-261.

[11] Frayn KN,Williams CM,Arner P.Are increased plasma non-esterified fatty acid concentrations a risk marker for coronary heart disease and other chronic diseases?Clin Sci(Lond),1996,90:243-253.

[12] Hu L,Deeney JT,Nolan CJ,et al.Regulation of lipolytic activity by long-chain acyl-coenzyme A in islets and adipocytes.Am J Physiol Endocrinol Metab,2005,289:E1085-E1092.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.021

湖北省自然基金(2003AA143)

430022，武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院内分泌科(王咏波现在大连医科大学附属第一医院内分泌科)

陈璐璐，Email:cheria_chen@sohu.com

2009-04-02)