整合素连接激酶在胰腺癌中的表达及意义

刘伟 宋少伟 马刚 石蕊 程颖 刘宁 郭克建

·论著·

整合素连接激酶在胰腺癌中的表达及意义

刘伟 宋少伟 马刚 石蕊 程颖 刘宁 郭克建

目的探讨整合素连接激酶(intergrin linked kinase, ILK)在胰腺癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学法和Western blotting法检测ILK在60例胰腺癌和32例癌旁正常胰腺组织中的表达，并分析其与临床病理参数的关系。结果免疫组化结果显示，ILK蛋白在胰腺癌细胞胞质内和胞膜上以及间质中均有表达，其阳性表达率为65.0%(39/60)，显著高于正常胰腺组织的18.8%(6/32，P<0.05)。Western blotting结果显示，ILK在胰腺癌组织中的相对表达量为303933±195116，显著高于正常胰腺组织的144613±30074(P<0.05)。在胰腺癌组织中，ILK表达与肿瘤的临床分期和淋巴结转移有关(P<0.05)，而与肿瘤分化程度无关。结论ILK在胰腺癌组织高表达，并与肿瘤的恶性程度相关。

胰腺肿瘤; 整合素连接激酶; 免疫组织化学; 蛋白质印迹法

材料与方法

一、临床资料

60例胰腺癌和32例癌旁正常胰腺组织标本均来自中国医科大学附属第一医院1990年至2008年手术切除的存档蜡块。2007年5月至2008年9月手术切除的10例胰腺癌患者另有术中从原发肿瘤及周围胰腺组织中获取并置-70℃冰箱保存的直径约0.5～1 cm新鲜组织块。

60例患者中男38例，女22例。年龄40～73岁，中位年龄57岁。高分化13例，中分化25例，低分化22例；按日本JPS临床分期，Ⅰ期9例，Ⅱ期17例，Ⅲ期24例，Ⅳ期10例。有淋巴结转移34例，无淋巴结转移26例。

二、免疫组化染色法检测ILK蛋白表达

60例胰腺癌及32例胰腺正常组织均行抗整合素连接激酶(ILK)的免疫组化染色。每一存档蜡块标本连续切片2张，经脱蜡、水化后严格按照链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P)法试剂盒(北京中衫金桥生物技术开发公司)说明书步骤进行。兔抗人ILK多克隆抗体(美国ABGENT公司)工作浓度为1∶50。以PBS代替一抗作为阴性对照。ILK蛋白表达于细胞质，黄色或淡黄染色。每张切片由3名病理科医师选择3个高倍视野，每视野计数100个细胞，染色细胞占总细胞数30%以上为阳性。

三、Western blotting检测ILK蛋白表达

100 mg新鲜胰腺组织加入1 ml细胞裂解缓冲液，提取组织总蛋白。经Larry法定量后，取50 μg蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白质印迹到硝酸纤维素膜上，用抗ILK抗体和抗β-actin抗体孵育，最后加入用碱性磷酸酶标记的山羊抗兔二抗，用o-DIANISIDINE,TETRAZOTIZED和β-NAPHTHYL ACID PHOSPHATE显色。应用Fluor Chemv2.0 Stand Alone电泳凝胶分析软件扫描测定各条带灰度值，以目的条带与β-actin条带灰度值之比作为ILK蛋白相对表达量。

四、统计学分析

结 果

一、胰腺组织ILK蛋白表达

免疫组化结果显示，ILK蛋白在胰腺癌细胞胞质内及胞膜上呈阳性表达，在胰腺癌组织的间质中也有阳性表达(图1)。胰腺癌组织ILK蛋白阳性表达率为65.0%(39/60)；癌旁正常胰腺组织的阳性表达率为18.8%(6/32)，两者差异有显著的统计学意义(P<0.05)。Western blotting结果显示，ILK在胰腺癌中及癌旁正常胰腺组织中的相对表达量分别为303 933±195 116和144 613± 30 074(图2)，癌组织ILK蛋白表达明显高于癌旁正常胰腺组织(t=2.55，P<0.05)。

二、胰腺癌组织ILK蛋白表达与肿瘤临床病理参数的关系

ILK蛋白表达与淋巴结转移、JPS临床分期相关(P<0.05)，与肿瘤分化程度无关(表1)。

表1 胰腺癌组织ILK蛋白表达与临床病理参数的关系

讨 论

整合素连接激酶是一种相对分子质量为59 000的丝/苏氨酸蛋白激酶，有4个锚蛋白重复序列，能与粘着斑复合物结合，并与生长因子受体酪氨酸激酶信号连接。研究表明，整合素介导细胞与细胞外基质相互作用，从而调节细胞的生存、增殖、分化和迁移[1]。ILK与整合素在胞质内相互作用[2]，作为一个支架连接整合素到肌动蛋白和信号转导通路形成多蛋白复合体。通过黏附到细胞外基质和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)依赖途径的生长因子激活ILK。在上皮细胞中，ILK的过表达导致停泊非依赖性细胞的增长[3]，细胞周期的延长，并且上调细胞调节蛋白D和细胞周期蛋白A的表达[4]以及在裸鼠中的致瘤性[5]，ILK能激活E-caherin的抑制物S-nail，可使E-cadherin表达下调、细胞间连接消失，导致肿瘤侵袭性增加[6]。在体外，ILK能磷酸化PKB/Akt，从而激活PKB转导通路，抑制上皮细胞的凋亡。ILK同时能使其下游的关键靶点GSK-3磷酸化，促使细胞由G1期向S期过渡[7]。ILK能上调MMP-9表达，并参与生长因子信号通路，从而在降解细胞外基质、促进肿瘤血管生成并活跃细胞运动能力等方面促进治疗细胞向淋巴结转移[8]。应用ILK抑制剂(QLT-0254)可明显抑制肿瘤的生长[9]。最近的研究表明，应用siRNA条件性地沉默ILK表达，结果几乎完全地抑制蛋白激酶B或者AKT激酶的活性，抑制丝氨酸GSK3β的磷酸化和cyclinD1表达[10]。另外，ILK在肿瘤血管的发生中起重要作用[11]。目前已证实，黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌和结肠癌[12-17]均高表达ILK。ILK的表达与肿瘤的浸润、转移和血管发生关系密切。

图1ILK在胰腺癌中呈阳性表达(1a.细胞质中；1b.间质中；1c.细胞膜上； ×200)图2胰腺癌组织(1、3、5、7、9和癌旁正常胰腺组织(2、4、6、8、10)ILK蛋白的表达

本实验结果显示，ILK在胰腺癌细胞中的阳性表达率为65%，明显高于在胰腺正常组织中的阳性表达率，ILK表达与肿瘤淋巴结转移和临床分期相关，这与ILK在胃癌和黑色素瘤中的研究结果一致，与Sawai等[18]在胰腺癌中的研究结果相同。但ILK在恶性肿瘤中的表达与肿瘤的分化是否有关结果不一。ILK在前列腺癌和卵巢癌中与肿瘤细胞分化相关，在胃癌中的表达与胃癌分化程度无关，Sawai等和本实验结果均显示ILK在胰腺癌的表达与胰腺癌的分化程度无关。因此，在这一方面还有待于进一步研究。

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2009-04-07)

(本文编辑：屠振兴)

Expressionandsignificanceofintegrinlinkedkinaseinpancreaticcarcinoma

LIUWei,SONGShao-wei,MAGang,SHIRui,CHENGYing,LIUNing,GUOKe-jian.

DepartmentofGastrointestrinalandPancreaticSurgery,FirstAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China

SONGShao-wei,Email：songsw10@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of intergrin linked kinase (ILK) in pancreatic carcinoma.MethodsILK protein was detected by immunohistochemistry and Western blotting in 60 cases of pancreatic carcinoma and 32 cases of normal pancreatic tissue, and the relationship with the clinicopathological characteristics were analyzed.ResultsImmunohistochemistry showed ILK was expressed in cytoplasm and membrane of pancreatic carcinoma cells and the positive rate was 65% (39/60), which was significantly higher than 18.75%(6/32) of normal pancreatic tissue(P<0.05). Western blotting showed the expression of ILK in pancreatic carcinoma tissue was 303933±195116, which was significantly higher than 144613±30074 of normal pancreatic tissue (P<0.05). In pancreatic carcinoma, the expression of ILK was correlated with clinical stage and lymph metastasis (P<0.05), but not correlated with tumor cell differentiation (P>0.05).ConclusionsILK protein was highly expressed in pancreatic carcinoma tissue and it was correlated with the degree of malignancy.

Pancreatic neoplasms; Intergrin linked kinase; Immunohistochemistry; Western blotting

整合素连接激酶(integrin linked kinase，ILK)作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶是多种致瘤相关因素的上游交叉点，在细胞与细胞外基质(ECM)的粘连中起到分子支架的作用，同时还参与多种信号转导途径，在细胞黏附、信号转导、细胞周期等多方面影响肿瘤的形成、增殖、侵袭和转移。本实验检测ILK在胰腺癌组织中的表达，并分析其与临床病理参数的关系。

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.010

辽宁省教育厅2009高等学校科研项目(2009A783)

110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院普通外科教研室胃肠胰外科

宋少伟，Email：songsw10@hotmail.com