膜联蛋白A1和增殖细胞核抗原在胰腺癌组织中的表达及其相互关系

倪晓光 白晓枫 王贵齐 刘尚梅 郭冰 赵平

·论著·

膜联蛋白A1和增殖细胞核抗原在胰腺癌组织中的表达及其相互关系

倪晓光 白晓枫 王贵齐 刘尚梅 郭冰 赵平

目的研究膜联蛋白A1(annexin A1，ANXA1)在胰腺癌中的表达及其与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的相关性。方法应用组织芯片制作仪构建芯片，芯片上有39例正常胰腺组织，42例胰腺癌组织，7例胰岛细胞瘤组织，8例壶腹腺癌组织。在连续的芯片切片上使用免疫组化法检测ANXA1和PCNA蛋白的表达，分析两者的相关性。结果构建的组织芯片在免疫组化染色后的掉片率为11.7%～13.3%，满足实验要求。ANXA1在胰腺癌中的阳性表达率为71.4%(30/42)，明显高于正常胰腺组织18.4%(7/38)的阳性率(P<0.01)。PCNA在胰腺癌中的阳性表达率为73.8%(31/42)，也明显高于正常胰腺组织22.2%(8/36)的阳性率(P<0.01)。胰腺癌组织ANXA1表达与PCNA表达显著相关(P<0.01)。结论胰腺癌ANXA1蛋白的表达与PCNA表达同步增加。

胰腺肿瘤； 膜联蛋白A1； 增殖细胞核抗原； 组织芯片

使用基因组学和蛋白质组学等高通量技术手段筛选出一些在胰腺癌与正常胰腺组织之间差异表达的分子，不仅有助于认识胰腺癌变的分子机制，更有助于发掘新的胰腺癌诊断标志物及治疗靶标。膜联蛋白A1(annexin A1，ANXA1)是我们前期发现的一个在胰腺癌中表达明显增强的蛋白质[1]，本研究采用免疫组化方法检测ANXA1与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在胰腺癌中的表达，探讨ANXA1在胰腺癌发病中的分子机制。

材料和方法

一、标本来源和临床资料

收集中国医学科学院肿瘤医院及牡丹江市结核肿瘤医院1990年1月至2002年8月的存档蜡块标本57例，其中男37例，女20例，年龄19～71岁，中位年龄60岁。将蜡块标本切片，由高年资病理医师重新进行诊断。最后确诊胰腺导管腺癌32例，其中高分化4例，中分化17例，低分化11例；胰腺黏液腺癌6例；胰腺腺泡细胞癌4例；胰岛细胞瘤7例；壶腹部腺癌8例。所有病例术前均未接受放、化疗。

二、组织芯片的构建

根据HE染色结果，在对应的供体蜡块上标记出含有所需要的肿瘤或正常胰腺组织(39例)的目标区域，应用组织芯片制作仪(Beecher Instruments, Silver Spring, MD)，用直径0.6 mm的空心细针从供体蜡块吸取组织，按预先设计好的排列方式安放在已打好孔的受体蜡块的适当位置。完成排列后，将组织阵列石蜡块以5 μm厚度连续切片，贴敷于载玻片，56℃烤片5 h以上。切片做常规HE染色，验证组织芯片是否与设计相符。

三、ANXA1和PCNA蛋白检测

采用免疫组化SP染色法，试剂盒购自福建迈新公司。小鼠抗人ANXA1单抗(美国BD Biosciences Pharmingen)1∶100稀释，PCNA单抗(中山生物技术有限公司)1∶150稀释。以已知阳性组织切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。结果判定[2]：按阳性区域染色强度评分，无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；按阳性细胞所占比例评分，<1%为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。两分值相乘，>3分为阳性。

四、统计学分析

应用SPSS11.5软件包进行统计分析。免疫组化结果采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关性检验，以P<0.05为差异具有显著性。

结 果

一、组织芯片的构建

芯片上有39例正常胰腺组织，42例胰腺癌组织，7例胰岛细胞瘤组织，8例壶腹腺癌组织，每例取2～3个组织点，共排列了256个点。切片经HE染色后，组织学可观测率为95.3%(244/256)。ANXA1免疫组化染色，切片的组织掉片或皱折率为13.3%(34/256)，其中1例正常胰腺和1例壶腹腺癌组织的所有组织点均脱片；PCNA免疫组化染色，切片的组织掉片或皱折率为11.7%(30/256)，其中3例正常胰腺和1例壶腹腺癌组织的所有组织点均脱片。

二、ANXA1和PCNA蛋白表达

正常胰腺组织中，少数散在的腺泡和导管细胞的胞质和细胞核可见ANXA1的表达(图1a)，阳性率为18.4%(7/38)。胰腺癌细胞的胞质和细胞膜可见ANXA1表达(图1b)，阳性率为71.4%(30/42)，其中导管腺癌、黏液腺癌、腺泡细胞癌的ANXA1阳性表达率分别为75.0%(24/32)、83.3%(5/6)、25.0%(1/4)；胰岛细胞瘤和壶腹腺癌的阳性率均为57.1%(4/7)。各类肿瘤的阳性率均明显高于正常胰腺组织(P<0.01)，但各类肿瘤间无显著差异。

正常胰腺组织中，少量腺泡细胞的细胞核中有PCNA表达(图1c)，阳性率为22.2%(8/36)。胰腺癌细胞的胞核中有PCNA表达(图1d)，阳性率为73.8%(31/42)，其中导管腺癌、黏液腺癌、腺泡细胞癌的PCNC阳性率分别为81.2%(26/32)、66.7%(4/6)、25.0%(1/4)；胰岛细胞瘤和壶腹腺癌的阳性表达率分别为42.9%(3/7)和71.4%(5/7)。各类肿瘤的阳性率均显著高于正常胰腺组织(P<0.01)，但各类肿瘤间无显著差异。

三、胰腺癌中ANXA1与PCNA表达的相关性

在2张连续的切片上分别行ANXA1和PCNA免疫组化染色(图2)。42例胰腺癌中，ANXA1与PCNA同时阳性表达25例(59.5%)，同时阴性表达6例(14.3%)，存在显著的相关性(P<0.01)。其中11例低分化胰腺导管腺癌中9例同时阳性表达，8例转移性胰腺导管腺癌中6例同时阳性表达。

图1正常胰腺、胰腺癌组织中ANXA1(a、b)和PCNC(c、d)的表达(免疫组化 ×400)

图2同一病例连续胰腺癌组织芯片切片的ANXA1(a)和PCNA(b)的表达 (免疫组化 ×100)

讨 论

组织芯片是将数十、数百乃至上千个不同个体的组织标本按预先设计的顺序排列在某一载体上而组成的微缩组织切片。使用组织芯片可以在严格、均一的实验条件下，快速、平行地检测大批量组织样本中的一个或多个实验指标，明显地提高了研究效率，同时使实验结果更具可比性。本文构建的胰腺癌组织芯片，免疫组化染色后的掉片率仅11.7%～13.3%，能满足研究的要求。

Annexins家族是一组结构相似的蛋白质，含有高度保守的4或8个重复序列组成的C-末端，构成其核心结构域，表现出与钙和磷脂结合的特性。其N-末端结构域在长度和序列的差异使Annexins家族成员表现出不同的生物活性，包括信号转导、DNA

复制、细胞转化、离子通道形成和细胞凋亡等[3]。ANXA1是其家族中研究比较深入的一个成员，具有糖皮质激素样作用，参与抑制细胞增殖、对抗炎症反应、调节细胞分化以及调节下丘脑-垂体轴等过程[4]。ANXA1在人恶性肿瘤如鼻咽癌、宫颈癌、前列腺癌、食管鳞状细胞癌和头颈鳞状细胞癌中表达降低，在结肠癌、食管和胃交界处的腺癌、肾透明细胞癌、肺癌、垂体瘤、肝癌、毛细胞白血病和脑恶性胶质瘤中表达升高，而在乳腺癌中有高表达和低表达两种相反的报道[5]。本组结果显示，ANXA1蛋白在胰腺癌中高表达。

PCNA是一种在细胞周期调控中发挥重要功能的核蛋白，在DNA合成的G1期开始增加，S期达高峰，G2/M期明显下降[6]。本研究结果显示，胰腺癌组织中PCNA阳性表达率明显高于正常胰腺组织，与时开网等[7]的研究结果一致。本研究还显示，胰腺癌组织ANXA1与PCNA的表达存在明显的正相关，尤其在低分化和转移性胰腺导管腺癌中，提示增殖能力强和恶性程度高的胰腺癌细胞中ANXA1的表达明显增强。因此ANXA1可能是促进胰腺癌进展的一个重要分子标记，值得进一步深入研究。

[1] Bai XF,Ni XG,Zhao P,et al.Overexpression of annexin 1 in pancreatic cancer and its clinical significance.World J Gastroenterol,2004,10:1466-1470.

[2] Friedrichs K,Gluba S,Eidtmann H,et al.Overexpression of p53 and prognosis in breast cancer.Cancer,1993,72:3641-3647.

[3] Moss SE,Morgan RO.The annexins.Genome Biol,2004,5:219.

[4] Perretti M,D′Acquisto F.Annexin A1 and glucocorticoids as effectors of the resolution of inflammation.Nat Rev Immunol,2009,9:62-70.

[5] 倪晓光，赵平，王贵齐.膜联蛋白A1的结构和功能及其与恶性肿瘤的关系.癌症进展,2010,8:63-66.

[6] Naryzhny SN.Proliferating cell nuclear antigen:a proteomics view.Cell Mol Life Sci,2008,65:3789-3808.

[7] 时开网,席鹏程,吴文澜.胰腺癌组织中VEGF、PCNA与血管生成的关系及预后相关性.胰腺病学,2006,6:95-97.

2009-10-12)

(本文编辑：吕芳萍)

ExpressionofannexinA1andPCNAinpancreaticcancerandtheircorrelation

NIXiao-guang,BAIXiao-feng,WANGGui-qi,LIUShang-mei,GUOBing,ZHAOPing.

DepartmentofEndoscopy,CancerInstitute&Hospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100021,China

ZHAOPing,Email:nixiaoguang@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expressions of the annexin A1 (ANXA1) in pancreatic cancer and the correlations with proliferating cell nuclear antigen (PCNA).MethodsTissue microarray instrument was used to construct the chip. There were 39 samples of normal pancreas tissue, 42 samples of pancreatic cancer, 7 samples of islet cell tumor and 8 samples of ampullary carcinoma. The expressions of ANXA1 and PCNA protein were examined by immunohistochemistry and their correlation was analyzed.ResultsThe off-chip rate of tissue chips after immunohistochemistry was 11.7%～13.3%, which could satisfy the needs for experiment. Immunohistochemical results of pancreatic cancer tissue microarray showed that the positive rate of ANXA1 expression in pancreatic cancer was 71.4% (30/42), which was significantly higher when compared with that of normal pancreas tissue (18.4%, 7/38;P<0.01). The positive rate of PCNA expression in pancreatic cancer was 73.8% (31/42), which was significantly higher than that of normal pancreas tissue (22.2%, 8/36;P<0.01). The expression of ANXA1 had a significant correlation with PCNA in pancreatic cancer (P<0.01).ConclusionsThe expression of ANXA1 protein was significantly increased in pancreatic cancer. The expression of ANXA1 was significantly correlated with the expression of PCNA.

Pancreatic neoplasms; Annexin A1; Proliferating cell nuclear antigen; Tissue microarray

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.007

北京市自然科学基金资助项目(7082057)，北京市科技新星计划(2007A105)

100021 北京，中国医学科学院肿瘤医院内镜科(倪晓光、王贵齐)，腹部外科(白晓枫、赵平)，病理科(刘尚梅)；牡丹江市第一人民医院头颈乳腺外科(郭冰)

赵平，Email：nixiaoguang@yahoo.com.cn