经卡介苗活化的负载PANC1裂解产物的树突状细胞疫苗体外抗胰腺癌作用

杨德红 刘文佳 陈敏 吴育美 邹晓平

·论著·

经卡介苗活化的负载PANC1裂解产物的树突状细胞疫苗体外抗胰腺癌作用

杨德红 刘文佳 陈敏 吴育美 邹晓平

目的探讨负载胰腺癌细胞株PANC1裂解产物(tumor lysate,TL)的树突状细胞(dendritic cells, DC)经卡介苗(CGB)活化后诱导的自体淋巴细胞体外抗胰腺癌效应。方法应用rhGM-CSF和rhIL-4从健康人外周血单个核细胞诱导培养DC,用TL负载DC，并用CGB促其成熟。倒置相差显微镜观察DC形态，流式细胞仪检测细胞CD1a、CD83、CD86及HLA-DR表型， ELISA法检测培养上清液中TNF-α和IL-12p70含量。CCK-8检测DC诱导自体混合淋巴细胞的增殖率以及活化淋巴细胞对PANC1、PaTu8988及SCG7901细胞的杀伤率。结果CGB活化负载TL的DC后，CD83和CD86阳性率分别从(3.7±0.3)%和(38.6±5.0)%显著增加至(16.5±0.6)%和(76.5±2.5)%(P<0.05)；DC分泌的IL-12p70和TNF-α量分别从(20.18±2.06)pg/ml和(61.38±1.19)pg/ml显著增加至(62.48±3.80)pg/ml和(592.53±17.96)pg/ml(P<0.01)；DC与自体混合淋巴细胞以1∶100、1∶50、1∶10、1∶5的比例共培养，淋巴细胞增殖率分别从(3.90±1.41)%、(4.07±0.40)%、(3.39±1.05)%、(2.82±0.39)%显著增加至(55.38±3.58)%、(75.00±2.54)%、(77.07±3.40)%、(99.07±2.40)%(P<0.01)；DC活化淋巴细胞对PANC1细胞的杀伤率在效靶比为1∶5、1∶10、1∶20、1∶50时分别可达(71.73±0.46)%、(49.44±0.98)%、(31.76±2.77)%、(19.03±3.04)%，但对PaTu8988和SCG7901细胞的杀伤率显著降低。结论经CGB活化的胰腺癌DC疫苗成熟度增加，体外表现出高效特异的抗胰腺癌细胞的效应。

胰腺肿瘤； 树突细胞； 卡介苗

随着肿瘤免疫治疗的研究进展，承载肿瘤抗原的树突状细胞(dendritic cells, DC)疫苗成为治疗恶性肿瘤的重要手段。联合应用IL-4和GM-CSF培养外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)可诱导出足够数量的DC用于临床治疗[1]。DC疫苗治疗肿瘤关键在于保证DC摄取肿瘤抗原后能够充分成熟，这样DC回输体内才能有效激活机体的抗肿瘤免疫反应。为促进DC成熟，可使用免疫佐剂[2]。卡介苗(Calmette-Guerin bacillus，CGB)是其中一种应用较广的微生物免疫佐剂。本实验用人胰腺癌细胞株PANC1裂解产物制备DC疫苗，并用CGB进一步促其成熟，观察DC成熟情况及用DC刺激的自体淋巴细胞对PANC1细胞的杀伤效应。

材料和方法

一、PANC1细胞裂解产物(TL)制备

PANC1胰腺癌细胞株购自上海生命科学院。常规培养后制成1×107/ml细胞悬液，经-80～37℃反复冻融5次，每次10 min后高速离心收集上清液，BCA法测定蛋白含量，-80℃保存备用。

二、DC体外诱导及自体混合淋巴细胞获取

健康人外周新鲜白细胞浓缩液(南京市中心血站)用PBS等容积稀释，采用密度梯度离心法获取PBMC，进一步用贴壁分离法获取DC前体细胞和自体混合淋巴细胞。混合淋巴细胞用含rhIL-2(800 μ/ml)的RPMI 1640液培养维持活力。DC前体细胞采用含rhGM-CSF(20 ng/ml)及rhIL-4(10 ng/ml)的RPMI 1640液(DC培养液)培养，第5天的DC为未成熟的DC(imDC)。将imDC分为4组，分别用CGB、TL、CGB+TL及DC培养液(阴性对照)刺激2 d，继续用DC培养液培养。为确定CGB最佳刺激剂量，先分别用30、60、90、300、500 μg的CGB刺激相同数量imDC，2 d后加入FITC标记人CD86单抗孵育，流式细胞仪检测CD86表型最多的DC组的CGB剂量为最佳刺激剂量。DC功能检测包括：(1)观察培养第5、7天DC大小、形态及集落生长情况；(2)将培养第7天各组DC分别与FITC标记人CD86、CD83、HLA-DR单抗以及PE标记人CD1a单抗共孵后,采用流式细胞仪检测DC的CD1a、CD83、CD86及HLA-DR表型(重复5次)；(3)ELISA法检测培养第6天收集的培养上清液中TNF-α、IL-12p70浓度(重复7次)。

三、DC刺激自体混合淋巴细胞的增殖及其对胰腺癌细胞的杀伤效应

在96孔板，将培养第7天各组DC与自体混合淋巴细胞按1∶5、1∶10、1∶50、1∶100的比例共培养4 d，同时设淋巴细胞及DC对照组。应用CCK-8测淋巴细胞活力，按说明书操作，最后测各孔细胞在450 nm波长处A值。按公式计算淋巴细胞增殖率：增殖率=[(实验组-DC对照组)-淋巴细胞对照组-空白孔]/(淋巴细胞对照组- 空白孔)×100%。

以1∶10共培养的混合淋巴细胞为活化淋巴细胞(效应细胞，E)，以PANC1为靶细胞(T)。按效靶比50∶1、20∶1、10∶1和5∶1共培养于96孔板，同时设单纯混合淋巴细胞为对照。培养3 d后应用CCK-8测肿瘤细胞活力，计算淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤率。杀伤率={[靶细胞对照组-(实验组-效应细胞对照组)]-空白孔}/(靶细胞对照组-空白孔)×100%。同样以CGB+TL组DC刺激的淋巴细胞与PANC1、PaTu8988、SCG7901细胞不同比例共培养后检测淋巴细胞对治疗细胞的杀伤率。以上实验均重复6次。

四、统计学方法

结 果

一、DC形态变化和DC表型测定

DC培养第5天形成明显的簇状细胞集落,悬浮或半悬浮。加入各组刺激后培养至第7天，可见CGB及CGB+TL组DC集落逐步散开，呈均匀散在分布，胞体明显增大,形状不规则,胞质丰富、透亮，表面有粗大树突状突起，为典型DC形态，而TL及阴性对照组DC形态较培养至第5天变化不明显(图1)。CGB的刺激剂量以90 μg时最佳(图2)。与阴性对照组比较，单纯TL刺激不增加CD83表型数量，甚至减少CD86表型数(P<0.05)。但CGB及CGB+TL组CD83及CD86表型数较TL组显著增加(P<0.01)，且CGB+TL组的增加较CGB组更显著(P<0.05)。而各组CD1a及HLA-DR表型无显著差异(表1)。

图1CGB刺激2 d后培养第5天(a, ×200)和第7天的CGB组(b)、CGB+TL组(c)、TL组(d)和阴性对照组(e)的DC形态(b～e， ×400)

组别例数CD1aCD83CD86HLA-DR阴性对照组529.7±1.23.7±0.338.6±5.098.1±0.4TL组529.9±1.25.2±0.2a32.9±2.2a98.2±0.4CGB组528.8±0.811.5±1.1abc76.6±2.4ab98.5±0.2TL+CGB组528.3±0.716.5±0.6abc76.5±2.5ab98.6±0.4

注：与阴性对照组比较，aP<0.05；与TL组比较，bP<0.01；与CGB组比较，cP<0.05

二、DC的IL-12p70和TNF-α分泌量的变化

阴性对照组、TL组、CGB组和CGB+TL组培养上清中IL-12p70含量分别为(20.18±2.06)pg/ml、(19.47±4.63)pg/ml、(59.18±2.88)pg/ml、(62.48±3.80)pg/ml；TNF-α含量为(61.38±1.19)pg/ml、(63.32±1.77)pg/ml、(498.23±13.29)pg/ml、(592.53±17.96)pg/ml。TL组与阴性对照组间无显著差异。但CGB组和CGB+TL组培养上清的IL-12p70和TNF-α含量均较TL组明显增加(P<0.01)，且CGB+TL组的TNF-α含量又较CGB组增加(P<0.05)。

三、DC对自体混合淋巴细胞增殖的影响

与阴性对照组比较，TL组的DC可显著增加淋巴细胞增殖率(P<0.01)，CGB组及CGB+TL组DC对自体混合淋巴细胞增殖率的影响又显著高于TL组DC(图3，P<0.01)。

四、DC活化的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应

未活化淋巴细胞(L)、阴性对照组(阴性对照-DC-L)及TL组DC活化的淋巴细胞(TL-DC-L)几乎不能杀伤PANC1细胞，CGB组DC活化的淋巴细胞(CGB-DC-L)较前3组有明显杀伤率，CGB+TL组DC活化淋巴细胞(CGB+TL-DC-L)则具有更高的杀伤率(表2，P值均<0.01)。虽然CGB+TL-DC-L对PANC1细胞有很高的杀伤率，但对PaTu8988和SCG7901杀伤率显著降低(表2，P<0.01)。

图3各组DC与自体混合淋巴细胞以不同比例共培养后的淋巴细胞增殖率

讨 论

DC是体内功能最强的专职APC,而肿瘤患者体内肿瘤细胞常能逃脱机体免疫监视，其中主要一个原因是DC数量明显减少，且处于免疫耐受状态[3]。因此DC疫苗治疗肿瘤需解决两个关键问题：一是能够获取足够数量的DC；二是获取的DC能激活抗肿瘤免疫反应。本实验用经典细胞因子诱导法培养的DC，CD1a阳性率近30%，并呈典型树突形态，表明细胞因子诱导可获得数量可观的DC。因未成熟DC(imDC) 低表达MHC分子及共刺激分子，可诱导免疫耐受，而成熟DC(mDC)高表达MHC分子及共刺激分子，诱导免疫激活[4]，所以DC的成熟度是影响DC效能的关键因素。单纯肿瘤抗原并不能促进DC成熟，本实验结果也如此，故需要免疫佐剂。

CGB是一种应用较广的微生物免疫佐剂。Kim等[5]研究证实，CGB活菌与imDC相互作用后能显著上调CD83、CD80、CD86及HLA-DR的表达。本结果也显示，经CGB进一步修饰后CD83及CD86表型的DC显著增加，表明DC明显成熟。

表2 各组DC活化的淋巴细胞对肿瘤细胞株的杀伤率

注：与TL-DC-L组比较，aP<0.01；与PANC1细胞组比较，bP<0.01

近年来的研究发现，TNF-α在DC成熟过程中有重要作用。用GM-CSF和IL-4刺激培养人外周血PBMC，于第7天加入TNF-α继续培养至第14天，与未加入TNF-α比较，DC表面CD83、CD80和CD86表达增强[6]。去血清培养mDC可使其产生大量活性氧中间产物而诱导自身凋亡，TNF-α可阻断这一过程[7]。本实验结果显示，CGB促进DC分泌大量TNF-α，提示CGB促进DC表型成熟可能与自身分泌TNF-α有关。但Kim等[5]发现中和CGB刺激的DC培养上清中的TNF-α，不能使CD83表达下降，得出CGB直接促DC成熟。因此CGB促进DC成熟是否与TNF-α分泌有关还需进一步实验验证。

抗肿瘤免疫反应主要为细胞免疫，主要效应细胞是CD8+细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，其发挥免疫杀伤功能需CD4+辅助性T细胞(T helper，Th)的调节。Th细胞可分为Th0、Th1、Th2三种类型，其中Th1激活并增强CTL的杀伤功能，形成激活型Th1反应；相反Th2抑制CTL活性，形成抑制型Th2反应。Th1、Th2由Th0 分化而来[8-9]。DC作用T淋巴细胞时分泌的细胞因子，即构成Th0细胞所在细胞因子微环境，可显著影响Th0细胞分化方向,其中IL-12p70使Th0显著向Th1分化，成为产生Th1优势的关键细胞因子[10]。本实验结果显示，CGB+TL能明显提高DC上清IL-12p70的浓度，从而增加向Th1的分化。

此外，本实验还发现：(1)单独CGB也能促进DC成熟，该组DC活化的淋巴细胞对PANC1细胞也有一定杀伤能力。考虑其原因为DC摄取CGB非特异性抗原后激活混合淋巴细胞中的NK细胞，可非特异杀伤肿瘤细胞[11]；CGB可诱导DC表达TRAIL[12]，后者与胰腺癌细胞表面的TRAIL受体结合后可导致肿瘤细胞凋亡[13]。(2)单纯TL致敏DC不能促进DC成熟，但可以轻度刺激淋巴细胞增殖，然而诱导的淋巴细胞对肿瘤细胞几乎无杀伤力。这可能是PANC1裂解产物中的自身抗原成分作用DC，使其诱导调节性T细胞及无反应性T细胞增生，从而引起免疫耐受[14]，导致不能杀伤肿瘤细胞。(3)负载PANC1 TL的DC仅对PANC1细胞具有高的杀伤率，显示其抗肿瘤细胞的特异性。

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2010-03-25)

(本文编辑：吕芳萍)

Invitroanti-tumoreffectofautologousmixedlymphocyteprimedbyBCGactivateddendriticcellsbasedPANC1lysate

YANGDe-hong,LIUWen-jia,CHENMin,WUYu-mei,ZOUXiao-ping.

DepartmentofGastroenterology,DrumTowerHospital,MedicalSchool,NanjingUniversity,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email：zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate in vitro anti tumor effect of host lymphocyte primed by Calmette-Guerin bacillus (CGB) activated dendritic cells (DC) based PANC1 lysate.MethodsDCs were obtained from peripheral blood mononuclear cells of healthy volunteer and cuitured by rhGM CSF and rhIL 4. DC vaccines for pancreatic cancer were loaded with PANC1 tumor lysate (TL) and were further maturated by CGB. CD1a, CD83, CD86and HLA-DR phenotype was characterized by flow cytometer, and IL-12p70 and TNF-α concentration in DC culture supernatant were measured by ELISA. Autologous mixed lymphocyte proliferation and the cytotoxicity of cytotoxic T lymphocytes primed by activated DCs to PANC1, PaTu8988 and SCG7901 tumor cells was measured by CCK 8 test.ResultsWhen DCs based PANC1 lysate were activated by CGB, the expression rates of CD83and CD86were increased from (3.7±0.3)% and (38.6±5.0)% to (16.5±0.6)% and (76.6±2.5)% (P<0.05). The concentrations of cytokines ILp12p70 and TNF-α were increased from (20.18±2.06)pg/ml and (61.38±1.19)pg/ml to (62.48±3.80)pg/ml and (592.53±17.96)pg/ml (P<0.01). When co-cultured with CGB activated DCs based PANC1 lysate in proportion of 1∶100,1∶50,1∶10 and 1∶5, the proliferation rate of the lymphocytes from (3.90±1.41)%,(4.07±0.40)%, (3.39±1.05)%, (2.82±0.39)% significantly increased to (55.38±3.58)%, (75.0±2.54)%, (77.07±3.4)%, (99.07±2.4)% (P<0.01), respectively. The killing effects of lymphocytes stimulated by DCs at E/T of 1∶5, 1∶10, 1∶20, 1∶50 were (71.73±0.46)%, (49.44±0.98)%, (31.76±2.77)%, (19.03±3.04)%; but the killing effects on PaTu8988 and SCG7901 were significantly decreased.ConclusionsDC vaccines for pancreatic cancer could be more maturated when activated by CGB, and could show a high capability of anti-tumor in vitro.

Pancreatic neoplasms; Dendritic cells; CGB vaccine

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.014

210008 南京，南京大学医学院附属鼓楼医院消化科

邹晓平，Email：zouxiaoping795@hotmail.com