趋化因子CCL20及其受体CCR6在急性坏死性胰腺炎中的表达及意义

周国雄 周德霞 丁晓凌 张海峰 张弘 成建萍 强晖 魏群 华国平

·论著·

趋化因子CCL20及其受体CCR6在急性坏死性胰腺炎中的表达及意义

周国雄 周德霞 丁晓凌 张海峰 张弘 成建萍 强晖 魏群 华国平

目的探讨CC趋化因子配体20(CCL20)和CC趋化因子受体6(CCR6)在实验性急性坏死性胰腺炎(ANP)发病机制中的作用。方法48只SD大鼠按完全随机法分为ANP组和对照组。采用胆胰管逆行注射4%牛磺胆酸钠建立大鼠ANP模型,以注射等容积生理盐水作为对照组。术后1 、3、6、12 h分批处死大鼠，取血检测血清淀粉酶，胰腺组织常规病理检查并评分，免疫组化和RT-PCR检测胰腺组织中CCL20、CCR6 mRNA及蛋白表达。结果ANP大鼠血清淀粉酶和胰腺组织病理评分明显高于对照组。ANP组术后胰腺组织CCL20 mRNA及蛋白表达呈时间依赖性增强(P<0.05)；术后6 h胰腺组织中CCR6 mRNA明显高于对照组(0.88±0.05对0.23±0.09，P<0.01)，术后12 h CCR6 mRNA表达较6 h时降低，但仍高于对照组(0.37±0.10对0.15±0.07，P<0.05)，CCR6蛋白变化与其mRNA变化一致。结论CCL20和CCR6参与ANP的发生和发展。

胰腺炎，急性坏死性； 趋化因子，CC; 趋化因子受体

细胞因子，尤其是趋化因子在急性坏死性胰腺炎(ANP)发病过程中所起的作用越来越受到人们的重视。CC趋化因子配体20(CC chemokine ligand 20, CCL20)是近来发现的 CC 趋化因子家族的新成员，主要表达于肝脏、肺、淋巴结、胰腺及外周血细胞[1]。CC趋化因子受体6(CC chemokine receptor 6, CCR6)是CCL20 的特异性趋化因子受体。CCL20主要表现为对表达CCR6的未成熟树突状细胞以及记忆/效应T细胞的趋化作用[2]。但它们在ANP 中的作用研究不多。本实验旨在探讨CCL20和CCR6在ANP发病过程中的作用。

材料与方法

一、实验分组及动物模型建立

健康雄性SD 大鼠48 只,清洁级,体重(250±30)g,由南通大学医学院动物实验中心提供。按完全随机法分为ANP组和对照组，各24 只。采用胆胰管内逆行注射4%牛磺胆酸钠1 ml/kg体重的方法制备ANP模型；对照组同法注射等容积生理盐水。术后1 、3 、6 、12 h分别随机选取6只大鼠处死。抽血分离血清，-80℃保存；取胰头部组织用10%中性甲醛固定，胰尾部组织立即置-80℃保存。

二、方法

1．血清淀粉酶测定：采用碘-淀粉比色法，由美国Vitros-250型全自动生化分析仪测定。

2．胰腺组织病理检查及评分：甲醛固定的胰腺组织行病理检查。由病理科医师盲法读片，每张切片随机选取10个高倍镜视野,参考Rongione等[3]的评分标准，从水肿、感染、出血和坏死4个方面评分,各项评分总和为最终分值。

3．CCL20和CCR6蛋白检测：采用常规免疫组织化学方法。羊抗大鼠CCL20多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)1∶100，羊抗大鼠CCR6多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)1∶50,用TBS代替一抗作为阴性对照。

4．CCL20、CCR6 mRNA检测：采用RT-PCR方法，试剂盒为南京天根生物技术服务有限公司产品。应用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取胰腺组织总RNA,根据Genbank中基因序列自行设计引物,由上海生工生物工程公司合成。CCL20引物序列为5′-CTGCTGGCTTACCTCTGC-3′和5′-ATTTCCTCCTTGGGCTGT-3′，产物298 bp；CCR6引物序列为5′-TCATCCCTTTGCTGTTTA-3′和5′-TCTGCCTGGAGATGTAGC-3′，产物411 bp；内参GAPDH引物序列为5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′和5′-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3′，产物484 bp。PCR反应参数：94℃ 3 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min ，30次循环，72℃ 5 min。PCR产物经凝胶电泳后用图像扫描仪测定光吸收值,以目的条带与GAPDH条带的光吸收值比为mRNA相对表达量。

三、统计学处理

结 果

一、血清淀粉酶变化

ANP组术后血淀粉酶水平较对照组明显升高(P<0.01)，术后6 h达到高峰，术后12 h稍有下降 (图1)。

图1 ANP组和对照组血清淀粉酶变化

二、胰腺组织病理积分

ANP组术后1、3 h见胰腺小叶间明显水肿,片状出血,炎性细胞浸润,腺泡细胞变性坏死;6、12 h小叶结构破坏,大量腺泡细胞浸润，大量炎性细胞坏死。ANP组胰腺病理评分明显高于对照组(P<0.01，图2)。

图2 ANP组和对照组的胰腺组织病理学评分

三、CCL20和CCR6蛋白表达的变化

CCL20蛋白主要表达于胰腺腺泡细胞，CCR6蛋白表达于淋巴细胞和胰腺腺泡细胞，胰岛细胞均不着色。对照组术后1、3 h见少量胰腺腺泡细胞有CCL20及CCR6蛋白弱表达，术后6、12 h腺泡细胞未见阳性表达(图3a、b)。ANP 组术后1 h至6 h，CCL20蛋白阳性表达的腺泡细胞数量逐渐增多，且细胞着色逐渐加深，术后12 h表达情况与术后6 h相似(图3c)；术后3 h腺泡细胞和淋巴细胞内可见较强的CCR6蛋白表达，术后6 h表达明显增强，且细胞着色逐渐加深 (图3d)，术后12 h CCR6蛋白表达较6 h减少。

a、b:对照组12 h CCL20、CCR6的蛋白表达(×200);c、d：ANP组12 h的CCL20和6 h的CCR6蛋白表达(×400 )

图3两组CCL20和CCR6蛋白表达(免疫组化)

四、CCL20 和CCR6 mRNA表达的变化

ANP组术后1、3、6、12 h胰腺组织CCL20 mRNA表达量分别为0.40±0.10、0.45±0.08、0.57±0.09、0.97±0.10，随时间延长表达逐渐升高；对照组的CCL20 mRNA表达量分别为0.26±0.09、0.24±0.05、0.21±0.05、0.18±0.04。ANP组CCL20 mRNA表达显著高于对照组(P<0.05或P<0.01，图4)。

1:Marker;2～5:对照组1、3、6、12 h;6～9:ANP组1、3、6、12 h

图4两组胰腺组织CCL20 mRNA的表达

ANP组术后1、3、6、12 h胰腺组织CCR6 mRNA表达量分别为0.28±0.05、0.76±0.08、0.88±0.05、0.37±0.10；对照组的CCR6 mRNA表达量分别为0.26±0.09、0.25±0.05、0.23±0.09、0.15±0.07。ANP组3 h和6 h的表达高于对照组(P<0.01)，12 h CCR6 mRNA表达较6 h下降，但仍较对照组显著升高(P<0.05，图5)。

1: Marker; 2～5:对照组1、3、6、12 h;6～9:ANP组1、3、6、12 h

图5两组胰腺组织CCR6 mRNA的表达

讨 论

趋化性细胞因子是一组结构相似的具有趋化功能的细胞因子，通过与靶细胞上相应的受体相互作用而行使它们的各种功能。CCL20表达于多种细胞及组织类型，诱导产生多种因子，广泛参与生理及病理过程。CCL20和其受体CCR6相互作用，在炎症局部发挥其诱导细胞聚集和维持稳态等作用。

本实验结果表明，ANP大鼠术后胰腺组织中CCL20 mRNA及蛋白的表达呈时间依赖性增加，提示CCL20参与ANP大鼠胰腺组织的损害。Akahoshi等[4]研究发现，中性粒细胞可在G+或G-菌的孵育下产生趋化因子。中性粒细胞可通过释放趋化因子启动抗原特异性免疫反应，这些趋化因子可以促进树突状细胞(DC)及T细胞的特异性聚集。Scapini等[5]认为，中性粒细胞在脂多糖(LPS)或TNF-α的刺激下可以表达释放CCL20。IL-10对LPS激活的中性粒细胞表达CCL20具有负调节作用。激活的中性粒细胞的培养上清液不仅使未成熟及成熟的DC产生趋化活性，还可激发快速整粘蛋白依赖的表达CCR6的淋巴细胞黏附于纯化的VCAM-1和ICAM-1。这种黏附作用均可被抗CCL20抗体抑制，表明存在于上清液中的CCL20具有生物学活性。鉴于这些趋化因子主要对DC及特殊的淋巴细胞亚群具有趋化活性，中性粒细胞产生的CCL20可使炎症部位聚集的这些细胞的类型更加多元，并促成炎症反应的调节。Nakayama等[6]研究发现，小鼠皮内注射IL-α、TNF-α可迅速诱导CCL20在局部的积聚，其受体CCR6在数小时之后同样随之升高，推测在致病因素的作用下胰腺的腺泡细胞受损，引起大量细胞因子、趋化因子的释放，导致中性粒细胞、巨噬细胞等在胰腺组织的聚集，随后局部释放大量炎症介质，在一些促炎症因子如IL-1β、TNF-α作用下激活NF-κB ，从而引起CCL20在局部的积聚。

本实验结果表明，ANP大鼠术后CCR6 mRNA和蛋白表达在6 h内明显升高，且与胰腺组织病理损伤程度呈正相关。然而，术后12 h的CCR6表达较6 h减弱，考虑可能与ANP急性进展期细胞免疫功能下降，T细胞数目相对减少或活性下降致CCR6表达减少有关。

[1] Rossi DL,Vicari AP,Franz-Bacon K,et al.Identification through bioinformatics of two new macrophage proinflammatory human chemokine:MIP-3 alpha and MIP-3 beta.J Immunol,1997,158:1033-1036.

[2] Dieu-Nosjean M C,Massacrier C,Homey B,et al.Macrophage in flammatory protein 3alpha is expressed at inflamed epithelial surfaces and is the most potent chemokine known in attracting Langerhans cell precursors.J Exp Med,2000,192:705-718.

[3] Rongione AJ,Kusske AM,Ashley SW,et al.Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in rat.Gastroenterology,1997,112:960-967.

[4] Akahoshi T,Sasahara T,Namai R,et al.Production of macrophage inflammatory protein 3alpha (MIP-3alpha) (CCL20) and MIP-3beta (CCL19) by human peripheral blood neutrophils in response to microbial pathogens.Infect Immun,2003,71:524-526.

[5] Scapini P,Laudanna C,Pinardi C,et al.Neutrophils produce biologically active macrophage inflammatory protein-3alpha (MIP-3alpha)/CCL20 and MIP-3beta/CCL19.Eur J Immunol，2001,31:1981-1988.

[6] Nakayama T,Fujisawa R,Yamada H,et al.Inducible expression of a CC chemokine liver-and activation-regulated chemokine (LARC)/macrophage inflammatory protein (MIP)-3 alpha/CCL20 by epidermal keratinocytes and its role in atopic dermatitis.Int Immunol,2001,13:95-103.

2009-08-14)

(本文编辑：屠振兴)

ExpressionandroleofCCchemokineligand20andCCchemokinereceptor6inthepancreasofratswithacutenecrotizingpancreatitis

ZHOUGuo-xiong,ZHOUDe-xia,DINGXiao-ling,ZHANGHai-feng,ZHANGHong,CHENGJian-ping,QIANGHui,WEIQun,HUAGuo-ping．

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospital,NantongUniversity,Nantong226001,China

ZHOUGuo-xiong,Email：zhouguoxiong@medmail．com．cn

ObjectiveTo investigate the role of CC chemokine ligand 20 (CCL20) and CC chemokine receptor 6 (CCR6) in the pathogenesis of acute necrotizing pancreatitis (ANP).Methods48 SD rats were randomly divided into two groups: control group and ANP group. The ANP model was induced by retrograde infusion of 4 % sodium taurocholate into the biliary and pancreatic duct in SD rats. The same amount of saline was injected in the control group. The rats were sacrificed at 1, 3, 6, 12 h, the serum amylase levels and the pathological score of the pancreas were measured. The expressions of CCL20 and CCR6 mRNA and protein in pancreas were detected by immunohistochemistry and semi-quantitative RT-PCR, respectively.ResultsThe levels of serum amylase and the histological score of ANP group were significantly higher than those of control group (P<0.01). The expression of pancreatic CCL20 mRNA and protein was increased in a time-dependant manner (P<0.05). The expression of pancreatic CCR6 mRNA at 6h was significantly higher than that of control group (0.88±0.05vs0.23±0.09,P<0.01). The expression of pancreatic CCR6 mRNA at 12h was decreased when compared with that of 6h group, but it was still higher than that of control group (0.37±0.10vs0.15±0.07,P<0.05), the change of CCR6 protein was consistent with that of CCR6 mRNA.ConclusionsCCL20 and CCR6 may play an important role in the pathogenesis of ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Chemokines CC; Chemokine receptor

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.013

南通市社会发展基金资助项目(S5054)

226001 江苏南通，南通大学附属医院消化科

周国雄,Email:zhouguoxiong@medmail.com.cn