药物敏感性试验在胰腺癌化疗药物选择中的作用

刘清华 张丽 朱明华

·论著·

药物敏感性试验在胰腺癌化疗药物选择中的作用

刘清华 张丽 朱明华

目的探讨MTT法体外药物敏感性试验在胰腺癌化疗药物选择中的作用。方法取156例胰腺癌患者的肿瘤组织进行体外原代细胞培养，以MTT法检测吉西他滨(GEM)、5氟脲嘧啶(5-FU)、丝裂霉素(MMC)、奥沙利铂(L-OHP)、伊立替康(CPT-11)、顺铂(DDP)对癌细胞的抑制率。按照实体瘤体外敏感标准，以抑制率>70%为高度敏感，50%～70%为中度敏感，<50%为不敏感(耐药)。结果156例胰腺癌标本经病理证实为导管癌135例、腺鳞癌13例、黏液腺癌8例。胰腺导管癌对6种药物均高度敏感；胰腺黏液腺癌和腺鳞癌对5种药物(分别除L-OHP和GPT-11外)高度敏感。GEM对胰腺癌细胞的抑制率高于MMC、L-OHP及CPT-11(P<0.05)，与5-FU和DDP无显著差异。其他5种药物之间无显著差异。不同类型的胰腺癌细胞对6种化疗药物的敏感性高低排序不同，导管癌对药物敏感性依次为GEM>DDP>5-FU>CPT-11>MMC>L-OHP；黏液腺癌为GEM、CPT-11>DDP、5-FU、MMC>L-OHP；腺鳞癌依次为L-OHP>GEM>5-FU、MMC>DDP>CPT-11。结论MTT体外药物敏感性试验有助于胰腺癌化疗药物的正确选择，具有一定临床应用价值。

胰腺肿瘤； 比色法； 药物监测； 肿瘤化疗

虽然目前胰腺癌的首选治疗方法仍然是手术切除，但由于其发现时多己属中、晚期，失去手术机会，所以药物治疗对于胰腺癌来说已经成为必不可少的治疗手段。本实验采用MTT法进行体外药物敏感性试验，探讨胰腺癌细胞在体外对常用抗肿瘤药物的敏感性，为临床胰腺癌化疗药物的选择提供参考依据。

材料与方法

一、材料

1．标本：选择长海医院2007年7月至2009年7月手术切除标本156例，经病理检查确诊为导管癌135例、腺鳞癌13例、黏液腺癌8例。这些患者均为首次治疗，术前未经过化疗或放疗。其中男性100例，女性56例，年龄30～82岁，平均61岁。

2．药敏试验的化学药物：选用目前常用的化疗药物6种：吉西他滨(GEM，江苏豪森药业股份有限公司)、5-氟脲嘧啶(5-FU，上海旭东海普药业有限公司)、丝裂霉素(MMC，浙江海正药业股份有限公司)、奥沙利铂(L-OHP，江苏恒瑞医药股份有限公司)、伊立替康(CPT-11，英国Aventis Pharma)、顺铂(DDP，齐鲁制药有限公司)。

二、体外药物敏感试验

无菌条件下取手术切除的新鲜癌组织约1cm3大小，放入含有青霉素、链霉素及庆大霉素的生理盐水中。尽量剔除肿瘤组织周围的脂肪、结缔组织和血块,选取无坏死部分的肿瘤组织，剪成尽可能小的碎块。再在200目不锈钢网上用眼科剪反复剪碎组织，并用注射器芯研磨过滤，用生理盐水洗1遍后1500 r/min离心15 min，弃上清液,用1640完全培养液配制成单细胞悬液，台盼蓝染色计数活细胞数，调整细胞浓度为5×105个/ml。取细胞悬液接种于96孔板，每孔180 μl，分别加药物终浓度为10倍和1倍血浆峰值浓度的6种抗癌药，置37℃、5% CO2孵箱培养48 h,然后加入MTT(终浓度为0.5 mg/ml)继续培养4 h,每孔加入DMSO 150 μl,室温震荡10 min,酶标仪测每孔A570值。每种药物每个浓度设2个复孔，同时设不加药物的对照组和不加细胞的空白组。抑制率=1-(实验组A570值/对照组A570值)×100%，实验组A570值=(高浓度组A570值+低浓度组A570值)/2。按照实体瘤体外敏感标准[1]，以抑制率>70%为高度敏感，50%～70%为中度敏感，<50%为不敏感(耐药)。

三、统计学分析

结 果

一、不同药物对胰腺癌细胞的抑制率

胰腺导管癌对6种化疗药物均高度敏感；胰腺黏液腺癌对L-OHP中度敏感，对其余5种化疗药物均高度敏感；胰腺腺鳞癌对CPT-11中度敏感，对其余5种化疗药物均高度敏感。三种类型的胰腺癌细胞对化疗药物敏感性相同(表1,P=0.866)，但化疗药物对胰腺癌细胞的抑制率不同(P=0.022)。GEM对胰腺癌细胞的抑制率较MMC、L-OHP及CPT-11高(P<0.05)，与5-FU及DDP相同(P>0.05)。5-FU、DDP、MMC、L-OHP和CPT-11对胰腺癌细胞的抑制率无显著差异(表2)。

二、胰腺癌对化疗药物敏感性的差异

三种组织类型不同的胰腺癌对6种化疗药物敏感性的高低排序不同(表3)。胰腺导管癌对药物敏感性依次为GEM>DDP>5-FU>CPT-11>MMC>L-OHP；胰腺黏液腺癌对药物的敏感性依次为GEM、CPT-11>DDP、5-FU、MMC>L-OHP；胰腺腺鳞癌依次为L-OHP>GEM>5-FU、MMC>DDP>CPT-11。

表1 6种化疗药物对胰腺导管癌、黏液腺癌和腺鳞癌细胞的抑制率

表2 6种化疗药物对胰腺癌细胞的抑制率比较(P值)

表3胰腺导管癌、黏液腺癌和腺鳞癌对6种化疗药物敏感性的比较(%)

药物胰腺导管癌(135例)高敏中敏耐药黏液腺癌(8例)高敏中敏耐药腺鳞癌(13例)高敏中敏耐药DDP69.627.43.062.537.5053.946.205-FU68.228.93.062.525.012.561.538.50MMC54.840.05.262.537.5061.538.50GEM73.325.90.775.025.0069.230.80L-OHP54.141.54.437.562.5084.615.40CPT-1160.036.33.775.025.0046.246.27.7

讨 论

化疗是胰腺癌综合治疗中的重要辅助手段之一，对化疗药物的正确选择将直接影响疗效。在临床实际工作中，往往会遇到同一种病理分型、同一临床分期，采用相同的化疗方案后，治疗效果却差别很大的情况，这主要是由于不同个体的胰腺癌细胞对抗癌药物的敏感性存在差异，即恶性肿瘤的“异质性(heterogeneity)”所致[2]。肿瘤对化疗药物的敏感性和耐药机制是复杂的，其最根本的原因可能是分子水平的差异。肿瘤的发生是一个多步骤过程，涉及多方面遗传因素的改变，肿瘤发生过程中各种风险因素的组合不同，就会使同一病理类型的肿瘤具有个体独特的遗传学特征。胰腺癌的等位基因型分析提示该肿瘤也符合“多步骤性”[3]。另外，肿瘤细胞本身对抗癌药物的耐药性也是造成化疗失败的重要原因[4]。如果仅凭传统的经验用同一种化疗药物或同一种固定性的化疗方案治疗不同的肿瘤患者，显然带有一定的盲目性。为提高化疗的疗效，需通过相对可靠的药物敏感性试验方法来选择化疗药物。Mosman[5]最早将MTT法应用于药物试验，因为它能反映活细胞存活和增殖情况。MTT比色法的优点是简便、快速、灵敏、重复性高、无放射性污染[6]，并可同时进行多种化疗药物的敏感性检测。近年来国内外大量研究结果表明，采用MTT体外肿瘤药物敏感试验法指导临床用药，取得了良好的相关性和疗效[7-8]。

本实验采用MTT法检测了6种常用化疗药物对胰腺癌细胞的体外抑制率。结果证明胰腺导管癌对6种药物均高度敏感；胰腺黏液腺癌和腺鳞癌对5种药物高度敏感。其中GEM对胰腺癌细胞的抑制率高于MMC、L-OHP及CPT-11，与5-FU和DDP对胰腺癌细胞的抑制率相同；其他几种药物对胰腺癌的抑制率比较差异无统计学意义，与临床治疗首选GEM情况相符。虽然三种类型的胰腺癌细胞对化疗药物敏感性相同，但对6种化疗药物敏感性有高低不同，即使同一种胰腺癌类型的不同的患者对同一种化疗药物的敏感性也不同。因此，通过原代培养进行MTT体外药物敏感性试验可以对胰腺癌患者实施个体化化疗，有助于提高疗效。

[1] 辛华雯，陈肖嘉，杜光祖，等．两种抗癌药物敏感性试验方法与临床相关性研究．中国医院药学杂志，1994，14：548．

[2] Mercer SJ,Somers SS,Knight LA,et al.Heterogeneity of chemosensitivity of esophageal and gastric carcinoma.Anticancer Drugs,2003,14:397-403.

[3] Blanck HM,Tolbert PE,Hoppin JA.Patterns of genetic alterations in pancreatic cancer:a pooled analysis.Environ Mol Mutagen,1999,33:111-122.

[4] Arlt A，Gehrz A，Müerköster S，et al. Role of NF-kappaB and Akt/PI3K in the resistance of pancreatic carcinoma cell lines against gemcitabine-induced cell death.Oncogene,2003,22:3243-3251.

[5] Mosman T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotxicity assays.J Immunol Methods,1983，65：55-63.

[6] Mueller H,Kassack MU，Wiese M.Comparison of the usefulness of the MTT,ATP,and calcein assays to predict the potency of cytotoxic agents in various human cancer cell lines.J Biomol Screen,2004,9:506-515.

[7] Wu B,Zhu JS,Zhang Y,et al.Predictive value of MTT assay as an in vitro chemosensitivity testing for gastric cancer:one institution′s experience.World J Gastroenterol,2008,14:3064-3068.

[8] Iwahashi M，Nakamori M，Nakamura M，et al．Individualized adjuvant chemotherapy guided by chemosensitivity test sequential to extended surgery for advanced gastric cancer．Anticancer Res,2005,25:3453-3459．

2009-09-28)

(本文编辑：吕芳萍)

Chemotherapyofpancreaticcancersbydrugsensitivitytestinvitro

LIUQing-hua,ZHANGLi,ZHUMing-hua.

DepartmentofPathology,ChanghaiHospital,Second，MilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ZHUMing-hua,Email:mhzhu2000@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effect of cancer drug sensitivity on the selection of chemotherapy for pancreatic cancer.MethodsThe cells from the cancer tissues of 156 pancreatic cancer patients were cultured with 6 kinds of chemotherapy drugs in vitro including gemcitabine (GEM), 5 fluorouracil (5-FU), Mitomycin C (MMC), Oxaliplatin (L-OHP) and irrinotecan (CPT-11), according to the in vitro standard of solitary tumor. More than 70% of inhibitory rate was highly sensitive, 50%～70% was moderately sensitive, <50% was insensitive. The inhibitory rate of chemotherapy drugs were determined by MTT colorimetric assay.ResultsThe pathological findings of the 156 cases of pancreatic cancer were pancreatic duct cancer in 135 cases, adenosquamous carcinoma in 13 cases, mucinous carcinoma in 8 cases. Pancreatic duct cancer was sensitive to all the 6 drugs; adenosquamous carcinoma and mucinous carcinoma was sensitive to all the drugs except for L-OHP and CPT-11, respectively. The inhibitory rate of GEM was higher than that of MMC, L-OHP and CPT-11 (P<0.05), but there was no difference with 5-FU and DDP (P>0.05). There was no difference among the other 5 drugs (P>0.05). However, the cells from different types of pancreatic cancers and the cells from different patients of the same type of pancreatic cancer have different sequence of sensitivity to the 6 kinds of chemotherapy drugs. For pancreatic duct cancer, the sequence of sensitivity was GEM>DDP>5-FU >CPT-11>MMC>L-OHP; adenosquamous carcinoma was GEM, CPT-11 >DDP, 5-FU, MMC>L-OHP; mucinous carcinoma was L-OHP>GEM >5-FU, MMC>DDP>CPT-11.ConclusionsCancer drug sensitivity test may help to select the right chemotherapy and be of clinical value.

Pancreatic neoplasms； Colorimetry； Drug monitoring； Chemotherapy

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.011

国家自然科学基金(30770996)，国家科技支撑计划(2006BAI02A14)

200433 上海，第二军医大学长海医院病理科

朱明华，Email:mhzhu2000@hotmail.com