实验性变态反应性脑脊髓炎豚鼠外周血单个核细胞分泌IL-4量的研究

泸州医学院附属医院神经内科(泸州 646000)

吕志宇 李晓红 荣本兵 李作孝*

多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统白质脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病。实验性变态反应性脑脊髓炎模型(Experimental allergic encephalomyelitis,EAE)与MS具有很多共同的特征,是国际公认的MS动物模型[1]。研究认为MS和EAE是由Th1介导的自身免疫性疾病,与Th1/Th2比例失衡有关[2]。本研究通过观察EAE豚鼠发病的临床症状、PBMC分泌 IL-4的量及两者的相关性,探讨Th2型细胞因子 IL-4在 EAE发病中的作用。

材料和方法

1 实验动物 雌性健康豚鼠 30只,体重250～300g;健康 SD大鼠 5只,体重200～250g。以上两种动物均由泸州医学院实验动物科提供,都属于一级合格动物。

2 药物及主要试剂 IL-4 ELISA试剂盒,为晶美公司产品;淋巴细胞分离液(比重1.077±0.002g/ml,)为上海君创生物科技有限公司产品;弗氏完全佐剂(含卡介苗 10mg/ml),为sigma公司产品。

3 方 法

3.1 免疫抗原制备:将大鼠处死后,迅速取出脊髓,用匀浆器制成50%(重量 /体积)的脊髓冰生理盐水匀浆,后与等量的弗氏完全佐剂(卡介苗 10mg/ml)混合,用注射器抽打至油包水乳剂,制成粗制髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)。用粗制 MBP抗原注入豚鼠后足掌皮下,每侧 0.3ml制造 EAE模型。

3.2 实验分组、动物模型制备:将30只雌性豚鼠随机分为3组并进行编号:分别为正常对照组、EAE模型组及佐剂对照组,每组均为10只。

3.3 EAE豚鼠发病情况记录及神经功能障碍评分:豚鼠致敏后,每天同一时间(10∶00AM)对实验豚鼠进行称重并对各 EAE组豚鼠发病情况进行记录以及神经功能障碍评分。神经功能障碍评分标准:0分:无明显异常;1分:后肢不全瘫痪;2分:后肢完全瘫痪;3分:后肢全瘫伴前肢不全瘫;4分:四肢全瘫或死亡。症状介于两条标准之间者以±0.5分计。

3.4 实验终止:将四肢瘫痪、死亡或连续3d症状评分无加重时作为发病的高峰期,在发病高峰期处死动物;未发病的动物观察4周后处死;正常对照组 4周后处死。

3.5 PBMC培养上清液 IL-4水平测定:取肝素抗凝的眶静脉血用 Hanks液稀释一倍,将其轻铺在葡聚糖泛影蒲胺(Ficll-Urografin)分层液(比重1.077)上,然后用水平离心机离心单个核细胞悬于分层液上层。用毛吸吸管吸取单个核细胞层,加入Hanks液清洗、离心。加入含5%的小牛血清RPMI-1640培养基制成细胞悬液(细胞计数 2×105)。经检测活细胞比例均＞95%。取1ml调配完毕的细胞悬液放入培养皿中,加入ConA(终含量为10μg/ml)放置于37℃,5%CO2培养箱中孵育4h以激活单个核细胞,收集上清液,-20℃保存。收集保存的上清液标本于半月内解冻,离心除去沉淀物。ELISA法检测 IL-4含量,检测按说明书方法进行。

结 果

1 临床症状:正常对照组及佐剂对照组均未发病,EAE模型组所有豚鼠均有发病,潜伏期为11.8±2.4d,进展期为7.4±2.1d,高峰期神经功能障碍评分为3.4±0.7分。患病豚鼠表现为皮毛脱落、体重下降、肢体无力、自伤后肢,重者四肢瘫痪、抽搐、死亡。

2 各组豚鼠 PBMC分泌 IL-4的水平,见表1。EAE模型组豚鼠发病高峰期 PBMC分泌 IL-4的量较正常对照组显著升高(P＜0.01);而佐剂对照组PBMC分泌 IL-4的量与正常对照组差异无统计学意义。

表1 各组豚鼠 PBMC分泌 IL-4水平(±s)

表1 各组豚鼠 PBMC分泌 IL-4水平(±s)

注:与正常对照组比较,* P ＜0.01,△＞0.05;与EAE模型组比较,# P ＜0.01

EAE模型组 10 14.04±3.17*佐剂对照组 10 20.41±3.16△#F值 16.48 P值 ＜0.01

3 EAE模型组豚鼠 PBMC分泌 IL-4的量与发病潜伏期、进展期、神经功能障碍评分相关性分析,见表2。EAE模型组豚鼠 PBMC分泌IL-4的量与豚鼠发病潜伏期呈正相关(P＜0.05),而与发病进展期及高峰期神经功能障碍评分呈负相关(P＜0.05)。

表2 IL-4的水平与潜伏期、进展期、神经功能障碍评分相关性分析

讨 论

EAE动物模型建立的关键因素是致敏抗原和敏感品系动物的选择,本实验采用易致敏且在国内易获得的豚鼠作为致敏动物,用粗制 MBP作为抗原诱发EAE[3]。EAE模型在接种平均 12d后出现厌食、体重下降,不同程度的肢体瘫痪,且均表现为单病程发病。组织病理学变化主要为CNS白质内小血管周围有大量炎性细胞浸润。与经典的EAE表现吻合,证明造模成功。

根据CD4+T细胞所产生细胞因子的种类,可将其分为Thl和Th2细胞。两类细胞所分泌的细胞因子谱及其生物学功能均有所不同,Thl细胞主要参与细胞免疫,介导与细胞毒和迟发型超敏性反应有关的应答,故 Thl细胞亦称为迟发型超敏性性 T细胞(TDTH细胞);Th2细胞主要功能是增强 B细胞介导的体液免疫应答。Thl细胞主要分泌 IFN-α,IL-2、IL-12和TNF-α等促炎性细胞因子,Th2细胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等抗炎性细胞因子。Thl和Th2细胞可通过各自分泌的细胞因子彼此抑制。正常情况下,Thl和Th2细胞及其分泌的细胞因子处于动态平衡中,并受到机体的严格调控[4]。近年发现,如果Th 1/Th2平衡发生偏离可导致一些自身免疫性疾病的发生[5,6]。

IL-4作为Th2细胞因子,能下调 Th1型细胞活性,抑制 Th1型细胞因子如 IFN-γ的作用。给 NOD小鼠投以 IL-4可防止或延缓小鼠产生 Th1细胞介导的自身免疫病型糖尿病,产生口服耐受和EAE恢复期的动物IL-4表达增强。因此IL-4可作为免疫调节因子抑制迟发型超敏反应,治疗EAE[7]。吕雪莹[8]等人认为在疾病的急性期免疫抑制因子 IL-4浓度低于正常水平,不能抑制 IFN-γ的促发和促进的CNS自身免疫反应及致炎性脱髓鞘作用。而 IL-4可能在恢复期起作用,通过其产生细胞Th2抑制Th1细胞的活化及炎性细胞因子的分泌,从而促使 EAE恢复。本实验通过对EAE豚鼠 PBMC培养上清液中具代表性的Th2类细胞因子 IL-4的检测,结果发现在发病高峰期,EAE模型组PBMC分泌 IL-4的量比正常对照组显著降低(P＜0.01),这说明 EAE豚鼠体内存在着免疫失衡,IL-4在EAE的发病中扮演重要的角色。

本实验的Person相关分析显示 EAE豚鼠 PBMC分泌的IL-4量与豚鼠发病的潜伏期呈正相关,与发病的进展期及神经功能障碍评分呈负相关(P＜0.05)。说明EAE豚鼠发病的严重程度与IL-4含量有相关性。

综上所述,EAE豚鼠体内存在免疫失衡,IL-4分泌量降低,且与发病的严重程度有相关性。检测MS患者血清 IL-4含量对判断疾病的活动性及严重程度有重要价值,可能对指导 MS的新药疗效有重要的临床价值。

[1] Render MP.The pathophysiology of acute experimental allergic encephalomyelitis in the rabbit[J].Brain,1994,107:699.

[2] Nakajima H,Fukuda K,Doi Y,etal.Expression of TH1/TH2-related chemokine receptors on peripheral T cells and correlation with clinical disease activity in patients with multiple sclerosis[J].Eur Neurol,2004,52(3):162-8.

[3] 荣本兵,李作孝.全脊髓匀浆建立豚鼠实验性自身免疫性脑脊炎模型[J].泸州医学院学报,2007,30(2):104-106.

[4] 赵武述.免疫平衡研究及其临床意义[M].北京:科学出版社,2005:100-101.

[5] Kidd P.Thl/Th2 Balance: The hypothesis,its limitations,and Implications for health and disease[J].Altern Med Rev,2003:8(3):223-246.

[6] 王良宏,肖林生.系统性红斑狼疮患者血中 Vα24-Vβ11 NK T细胞介导的免疫调节失调机制研究 [J].陕西医学杂志,2008,37(7):773-775.

[7] Renno T.Cytokine production by cells in the cerebrospinal fluid during EAE in SJI/J mice[J].J Neuroimmunol,1994:49(1-2):1-7.

[8] 吕雪莹,张凤蕴,王丽群,等.实验性变态反应性脑脊髓炎 IFN-γ及IL-4检测 [J].哈尔滨医科大学学报,1999,33(1):13-13.