硒化壳聚糖对NB4细胞增殖的影响及其与端粒酶活性和hTERT基因表达的关系△

郧阳医学院附属人民医院肿瘤中心(十堰442000)

邓守恒 曾小华* 曹凤军 类健翔 邓守明# 陈 萍

急性早幼粒细胞性白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)是急性白血病中的一种。临床上,维甲酸(Retinoic acid,RA)作为诱导分化剂可使大多数APL患者取得完全缓解,但会引起维甲酸相关综合征及存在着严重的耐药性,相当数量的APL患者在完全缓解后短期内复发。三氧化二砷可通过诱导细胞凋亡治疗 APL,但低剂量的三氧化二砷无法诱导 RA耐药的APL细胞分化或凋亡,而高剂量的砷及其化合物又可诱导多种不良反应使病人不能耐受[1]。化学结构上和砷属同族的硒是人和动物体内必需的微量元素之一,具有显著的防癌和抗癌作用。硒化壳聚糖[2]是利用亚硒酸和低分子壳聚糖通过拼合原理制备成的一种有机硒,理论上应该有抗 APL作用,且毒副作用应该比无机硒和砷小得多。本实验观察了硒化壳聚糖对体外培养的NB4细胞生长的抑制作用并探讨了这种作用与细胞端粒酶活性和人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,h TERT)基因表达的关系,现报告如下。

材料和方法

1 药品试剂仪器 硒化壳聚糖(批号:100601-200518)由福建医科大学药物化学系合成,经福建省分析测试中心检测,含硒量为0.4%,用培养液配成800mg/L的溶液待用;TRAPeze ELISA端粒酶检测试剂盒购自intergen公司;Trizol总RNA抽提试剂盒、Revert AidTMfirst strand cDNA synthesis kit为Fermentas产品。细胞培养板购自丹麦Nunclon公司;DG-3022型酶标仪(中国南京);AM-PLITRONⅡ型PCR扩增仪(美国 Barnscread/Thermolyme公司)。

2 细胞及培养 人急性早幼粒细胞性白血病NB4细胞引自福建省血液病研究所,培养于体积分数为10%新生牛血清,100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和2U/ml谷氨酰胺的RPMI 1640培养基内,于37℃、饱和湿度,5%CO2条件下培养。细胞接种24h后进入指数生长期。

3 MTT法检测硒化壳聚糖对细胞生长的抑制作用 在96孔培养板上接种处于指数生长期的NB4细胞,每孔加细胞悬液 100Ul,接种量 5×104/ml。实验孔加入等体积、不同浓度的硒化壳聚糖,对照孔加入等体积溶剂,设4个复孔。将培养板放至37℃,5%CO2培养箱中培养至所需时间,加入MTT溶液,继续培养 4h后,离心,弃上清,加入二甲基亚砜(DMSO),颗粒完全溶解后用酶标仪在 550nm处测定每孔的光密度值,重复3次。生长抑制率=(空白组光密度-实验组光密度)/空白组光密度×100%

4 端粒酶活性检测[3]分别收集不同浓度硒化壳聚糖作用 48h后的NB4细胞各 2×105个,PBS洗 2次,采用 TRAPPCR-ELISA法,在酶标仪上 450nm和690nm处测定A值,设未加药组为对照,结果△A值=A450-A690,△A值＜0.2为阴性,△A值＞0.8为阳性。

5 RT-PCR法检测 NB4细胞h TERT mRNA的水平 收集各组细胞各 3～5×106个,加1ml Trizol,按说明提取细胞总RNA,要求能够显示出清晰的28s及18s两条rRNA带,取细胞总 RNA 1μg,小鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus,M-MLV)200U,二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)0.2μmol/L,RNA酶抑制剂(RNase inhibitor,RNasin)20U,四种脱氧核糖核苷酸混合物(d NTP)20nmol/L,随机引物100ng,总反应体系为20μl,42℃反应 1h,70℃10min中止反应。取合成的cDNA模板 2μl,上下游引物各15pmol/L,Taq酶1U,d NTP5nmol/L用于PCR,94℃30s,58℃45s,72℃60s,35个循环,最后72℃5min,取PCR产物各 10μl,在含0.5μg/ml溴化乙锭的2%琼脂搪凝胶中进行电泳,紫外反射仪上观察、拍照。引物由上海sangon合成,hTERT;5’-CCGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3';5'-GGATGA AGCGGACTCTGGA-3',扩增片段为145bp,β-actin:5'-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3';5'-ATGTCACGCACGATTTCCCGC-3',扩增片段为501 bp。

结 果

1 硒化壳聚糖对NB4细胞生长抑制作用,见图1。MTT法检测显示,25～200mg/L的硒化壳聚糖对体外培养的NB4细胞生长均具有抑制作用,随着作用时间的延长和药物剂量的增加,抑制作用逐渐增强,呈现出明显的时效和量效关系。

2 硒化壳聚糖对NB4细胞端粒酶活性影响结果,见附表。从表中可见,未加药物组细胞内端粒酶活性较高,经 50 mg/L及以上浓度的药物作用 48h后,端粒酶活性均有一定程度的下降,药物浓度越高,端粒酶活性下降越明显。50mg/L组与未加药组比较有差异(P＜0.05),100、200 mg/L组与未加药组比较有显著差异(P＜0.01)。

附表 硒化壳聚糖对NB4细胞端粒酶活性的抑制作用(±s,n=4)

附表 硒化壳聚糖对NB4细胞端粒酶活性的抑制作用(±s,n=4)

注:与0mg/L组相比,* P＜0.05** P＜0.01

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3 硒化壳聚糖对NB4细胞h TERT mRNA水平的影响,见图2。图中 RT-PCR结果显示,未加药组细胞内 h TERTmRNA条带明亮,经不同浓度药物作用48h后,h TERTmRNA条带则逐渐变淡,50mg/L药物作用后,亮度约降至对照的一半,而经200mg/L药物作用后,则条带几乎看不清楚,呈现出明显的量效关系。

图1 硒化壳聚糖对NB4细胞生长的抑制作用

图2 硒化壳聚糖对 NB4细胞h TERTm RNA水平的影响

讨 论

端粒酶是一种由 RNA和蛋白质组成的逆转录酶,其作用是在复制期(S期)的线粒体末端添加TTAGGG重复片段,以弥补染色体由于细胞分裂所出现的末端进行性缩短。端粒可维护染色体的完整性,并参与染色体在细胞核内的定位及基因表达调控。端粒的长短和稳定性决定了细胞的寿命,并与衰老和癌变密切相关[4]。大多数的研究表明,人类正常体细胞中端粒酶常处于失活状态,而在多种肿瘤细胞内端粒酶呈阳性,在这些肿瘤细胞内由于缺乏调节端粒酶活性的机制,不能下调端粒酶活性使细胞停止分裂和退出细胞周期,从而使细胞无限增殖,获得永生性,故而端粒酶活性的调节可能是肿瘤治疗作用机制的一部分[5]。h TERT与端粒酶活性的发挥密切相关,h TERT m RNA水平在端粒酶活性高的细胞中往往上调[6],基于此,端粒酶活性和h TERT基因常被看作是评价抑癌效果的两个重要指标。为此,本实验观察并探讨了硒化壳聚糖对体外培养的NB4细胞生长的影响及其与端粒酶活性和h TERT基因表达的关系。

研究发现,硒化壳聚糖可使 NB4细胞的生长增殖受到抑制,25mg/L的硒化壳聚糖作用NB4细胞 24、48、72h,其抑制率分别为12.2%,13.7%,21.0%,抑制作用不太明显,当其浓度升高至50mg/L时,抑制率则分别上升为18.3%,29.2%和53.4%,抑制作用显著,再增加药物浓度,则抑制率进一步升高。进一步通过检测硒化壳聚糖作用48h后 NB4细胞内端粒酶活性和h TERT mRNA水平变化的结果表明,同对细胞生长的抑制作用特点相一致,经不同剂量硒化壳聚糖作用后,端粒酶活性和h TERT mRNA水平也呈剂量依赖性降低,说明硒化壳聚糖可以通过抑制NB4细胞端粒酶活性和h TERT表达来抑制细胞增殖。

有报道称,端粒酶活性的升高与细胞周期蛋白表达呈正相关[7]。本课题组前期研究结果发现[8],硒化壳聚糖可下调NB4细胞周期蛋白D1的表达,从而使端粒酶活性降低,而后者又可使细胞染色体末端缺失,染色体缺失又会使基因组变得不稳定,从而诱导细胞发生凋亡,抑制了细胞的无序增殖,这可能也是硒化壳聚糖能抗 APL的原因之一。

[1] Cai X,Shen YL,Zhu Q,etal.Arsenic trioxide-induced apoptosis and differentiation are associated respectively with mitochondrial transmembrane potential collapse and retinoic acid signaling pathways in acute promyelocytic leukemia.Leukemia,2000,14:262-270.

[2] 邓守恒,孙各琴,陈崇宏.Ca2+、cAMP、cGMP在硒化壳聚糖诱导的NB4细胞凋亡中的作用.陕西医学杂志,2007,36(4):415-417.

[3] 卫立辛,郭亚军,闫振林,等.检测人端粒酶活性的端粒酶TRAP-ELISA法的建立 [J].中华肿瘤杂志,1998,20(4):264-266.

[4] 杨松鹤,杨振华,薛景凤.衰老大鼠卵巢 SOD和端粒酶活性的变化及天年饮的保护作用.陕西中医,2009,30(10):1423.

[5] Kim NW.clinical implications of telomerase in cancer[J].Eur JCancer,1997,33(5):781-786.

[6] Meyeson M,Counter CM,Eaton EN,etal.Hest2,the putative human telomerase catalytic subunit gene is upregulated in tumor cells and during immortalization[J].Cell,1997,90:785-796.

[7] 吴清明,于皆平,张卫国,等.阻断泛素-蛋白酶体通路对胃癌细胞增殖和凋亡的影响[J].中华消化杂志,2004,24(2):102-105.

[8] 邓守恒,孙各琴,陈崇宏.硒化壳聚糖对 NB4细胞的周期阻断及与阿霉素的协同作用[J].中国药房,2007,18(10):741-743.