半夏白术天麻汤4种方法提取液指纹图谱比较

王淑玲，孙秀梅，张兆旺，谢 恬

(1.杭州师范大学 生物医药与健康研究中心，浙江 杭州 310012；2.山东中医药大学 药学院,山东 济南 250014)

半仿生提取法(Semi-bionic extraction,SBE法)是张兆旺教授和孙秀梅教授以灰思维为指导，为经消化道给药的中药及其复方，提出的一种中药药效物质提取新技术[1-6]，为了提高仿生化程度，在SBE法的基础上加入适宜的生物酶，形成了半仿生-生物酶法(Semi-bionic enzyme extraction,SBEE法)[7-8].半夏白术天麻汤来源于清代程国彭的《医学心悟》，由半夏、白术、橘红、甘草、天麻、茯苓6味中药组成，具有燥湿化痰、平肝息风的作用.主治风痰上扰所致眩晕头痛,胸闷呕恶,舌苔白腻,脉弦滑等症.现代主要用于高血压、美尼尔氏综合征、癫痫、中风后遗症等，是治疗风痰症的常用方，已有270余年的临床基础，现代仍广泛用于中医临床.目前该方的提取方法仍采用水提法.水提法易导致挥发性成分的流失，王淑玲等用SBEE法对半夏白术天麻汤进行了系统研究，SBEE法可以最大程度的提取活性混合物，克服水提法的缺点.实验首先优选了SBEE法提取工艺条件和较佳组合方式，然后对半夏白术天麻汤4种提取液(水提法、醇提法、SBE法、SBEE法)的指标成分进行比较(待发表)，在此基础上，为进一步比较不同提取液中成分的差异，该实验采用HPLC法，对不同方法提取液指纹图谱进行分析比较.指纹图谱具有综合的特点，适合作为含有多成分的中药及其复方的质量评价方法，目前利用指纹图谱研究半夏白术天麻汤较少.

1 仪器与材料

Agilent1100LC、G1311A四元泵、Agilent1100LC色谱工作站G1315A/BDAD检测器、G1316A柱温箱、Agilent1100LC在线真空脱气机、VP-ODS Shim-pack柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，日本岛津公司)，LD5-10B低速离心机(北京医用离心机厂).乙睛色谱纯(天津四友公司)，水为高纯水，其余试剂均为分析纯.

半夏白术天麻汤方中药材饮片经山东中医药大学张兆旺教授鉴定：半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit.的干燥块茎；天麻为兰科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥块茎；茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(schw.)Wolf.的干燥菌核；橘红为芸香科植物柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮；白术为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎；甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的根及根茎.

2 实验方法与结果

2.1 样品液的制备

王淑玲等课题组提供.

2.2 供试液的制备

分别取样品液各900 mL，分别离心(3 000 r/min，20 min)，合并上清液，浓缩并定容至500 mL，即得供试液A1～4(0.165 6 g/mL).精密吸取供试液A1～4各10 mL于磨口三角瓶中，慢慢加入乙醇使含醇量至50%，超声提取(250 W，40 KHz)30 min，放冷，滤过，浓缩至近干，残渣加乙腈-水(3∶97)混合溶液溶解，转移至5 mL量瓶中，并用乙腈-水(3∶97)混合溶液定容，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试液B1～4(0.331 2 g/mL).

2.3 流动相的确定

选择甲醇-水多个比例和乙腈-水多个比例的流动相.结果表明，多种流动相中以乙腈(A)-水(B)，线性梯度洗脱时间为0 min→45 min(A%：5%→45%)，45 min→60 min(A%：45%→100%)系统为较佳，图谱显示各个色谱峰(nm)的分离度较好，保留时间适中，因此选此流动相系统作为流动相.

2.4 检测波长的选择

通过紫外全波长扫描，选择220 nm、250 nm、280 nm、324 nm、414 nm波长处进行考察，通过DAD检测三维图谱，比较这5种检测波长下的色谱图，实验结果显示λ=324 nm时，图谱基线平稳，指纹峰数适中，分离度较好.因此选择λ=324 nm为检测波长.

2.5 色谱条件

色谱柱：DiamonsilTM(钻石)C18柱(200×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)；线性梯度洗脱时间程序如下：0 min→45 min(A%：5%→45%)，45 min→60 min(A%：45%→100%)；流速：1.0 mL/min；检测波长：324 nm；参比波长：400 nm；柱温：25 ℃；进样量20 μL.在此条件下，半夏白术天麻汤指纹色谱图中色谱峰较多，分离度好，特征性强，基线平稳.

2.6 共有特征指纹峰的标定

选择12个分离度好、峰面积较大的峰作为特征峰.各特征峰见图1.其中8号色谱峰(RT≌31.16 min，A%≌22.57%)积分百分比较大，且位于色谱峰的较中间位置，分离度较好，以此作为内参照峰.

图1 半夏白术天麻汤SBEE液指纹图谱Fig. 1 Fingerprint of Banxia Baizhu Tianma Decoction by SBEE

2.7 精密度试验

精密吸取2.2项下供试液B1，连续进样6次，按2.5项下液相色谱条件，依法测定，记录各共有峰保留时间和积分面积.以8号峰的保留时间(RT)和积分面积(A)为参照，换算出各共有峰的相对保留时间(RRT)和相对积分面积(RA).结果显示共有峰的RRT和RA基本一致，相对标准偏差均小于3%(RSD<3%).HPLC法分析精密度良好，见表1、表2.

2.8 稳定性试验

精密吸取2.2项下供试液B1，每隔一定时间进样1次，连续进样6次，按2.5项下液相色谱条件，依法测定，共有峰的RRT和RA基本一致，相对标准偏差均小于3%(RSD<3%).结果表明样品液在24 h内稳定，见表3、表4.

2.9 重现性试验

取2.1项下A1号供试液，按2.2项下供试液的制备方法平行提取5份，按2.5项下色谱条件，依法测定，考察各个特征峰的RRT和RA，结果相对标准偏差均小于3%.见表5、表6.

2.10 HPLC积分总面积测定

精密吸取2.2项下不同提取液的供试液B，分别平行进3针，按2.5项下液相色谱条件，依法测定，结果见表7.

表1 特征峰相对保留时间(RRT)的精密度(n=6)

表2 特征峰积分相对比值(RA)的精密度(n=6)

表3 特征峰相对保留时间(RRT)的稳定性(n=5)

表4 特征峰积分相对比值(RA)的稳定性(n=5)

表5 特征峰相对保留时间(RRT)的重现性(n=5)

表6 特征峰积分相对比值(RA)的重现性(n=5)

表7 HPLC总面积测定结果

2.11 特征峰峰面积的比较

不同方法提取液12个特征峰峰面积见表8.

为便于比较，将不同方法提取液特征峰峰面积都除以SBEE液的特征峰峰面积，并求平均值，结果见表9.色谱图见图2～图5.

表8 4种方法提取液指纹图谱特征峰峰面积

表9 特征峰峰面积与SBEE液特征峰峰面积的比值

图2 SBEE液HPLC指纹图谱Fig. 2 Fingerprint of extract by SBEE for HPLC

图3 SBE液HPLC指纹图谱Fig. 3 Fingerprint of extract by SBE for HPLC

图4 WE液HPLC指纹图谱Fig. 4 Fingerprint of extract by WE for HPLC

图5 AE液HPLC指纹图谱Fig. 5 Fingerprint of extract by AE for HPLC

2.12 特征峰重叠率、检出率、总差异率的比较

以SBEE提取液图谱为标准图谱，按下面公式分别计算不同方法提取液的共有峰重叠率、特征峰检出率、总差异率，结果见表10.

式中：Aij—待测样品中某个特征峰的面积；Aik—SBEE提取液中某个特征峰的面积；n—特征指纹峰的总数.

表10 共有峰重叠率、检出率、总差异率

2.13 相似度的比较[9]

以SBEE提取液图谱为标准图谱，利用相关系数、夹角余弦值与欧氏距离测度方法，按下面公式分别计算不同方法提取液指纹图谱的相似度，结果见表11.

表11 4种方法提取液指纹图谱相似度

3 讨 论

文章对半夏白术天麻汤4种方法提取液进行了HPLC指纹图谱的比较，选取了12个特征峰进行分析，4种方法提取液HPLC指纹图谱的特征峰总面积大小顺序为SBEE>SBE>WE>AE.12个特征峰中7个以SBEE液的面积最大，初步说明，对于半夏白术天麻汤中具有324 nm紫外吸收的成分，SBEE液提取率优于其他3种方法.

4种方法提取液共有峰重叠率和特征峰检出率都为100%，而相似度和总差异率不同，表明4种提取液所含化学成分种类基本相同，但含量有差异.其中SBEE液与SBE液的色谱图峰形非常相似，但总面积SBEE液大，说明SBEE与SBE法提取成分相近，效果SBEE法较SBE法为佳.

用相关系数、夹角余弦测度与欧氏距离测度方法检测不同方法提取液的指纹图谱与SBEE液的相似度，夹角余弦测度与相关系数测度的评价结果接近，相比较而言，夹角余弦测度法对于检测指纹图谱间谱峰比例关系的变动较为适宜；欧氏距离测度法则具有较好的综合评价能力，欧氏距离DE越大，其类间相似性越小，SBE液与SBEE液的欧氏距离最小，说明相似性最大.实验结果表明3种测度结果一致，SBE液与SBEE液所含成分最相近，并且提取率仅次于SBEE液.

(鉴于知识产权问题，暂不宜公开样品液的制备部分.)

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[6] 王淑玲，孙云廷.中医系统论与中药复方研究[J].时珍国医国药,2008,19(1):212-213.

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