鸦胆子提取物对小鼠脾淋巴细胞内NO-cGMP转导系统的影响

程富胜,胡振英,辛蕊华,罗永江,董鹏程

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所新兽药工程重点实验室,甘肃兰州730050)

鸦胆子味苦,性寒,有毒,传统上治疗休息痢和疟疾等,现代药理研究证实鸦胆子具有杀灭阿米巴原虫、抗疟、抗寄生虫、抗肿瘤、降低血压等作用[1]。一氧化氮(NO)的基本生物学作用之一是在细胞间信息交换中起作用。研究表明,是NO作用于靶细胞并在鸟苷酸环化酶(GC)的作用下产生的主要第二信使,进而环磷酸鸟苷(cGMP)通过下游许多分子发挥NO的作用[2]。NO的作用方式独特,它代表一类新的细胞信使分子,是“气体性、亲脂性”的,这种特性与NO可能具有的广泛生物学功能有很大的相关性。资料表明,L-Arg-NO-cGMP通路在人类和动物多种组织和细胞中广泛存在,它代表着一种细胞间信息传递和细胞功能调节的新的信号传导机制[3]。本试验通过研究鸦胆子提取物对脾淋巴细胞内NO、cGMP含量的变化,分析了鸦胆子提取物对NO-cGMP信号系统的影响,为研究鸦胆子抗寄生虫提供理论依据。

1 试验材料

1.1 药物 鸦胆子提取由课题组提取、分离、纯化。

1.2 实验动物 昆明系小鼠,体重18～22 g,雄性,健康;由甘肃省肿瘤医院实验动物中心提供。

1.3 主要仪器和试剂 RPMI-1640粉剂(Gibco),cGMP放射免疫试剂盒购自上海医科大学,Griess试剂、1 mmol/L NaNO2标准液为国产分析纯。岛津UV-3000紫外可见光分光光度计,智能放免γ-测量仪(SN-695B型,上海原子核研究所日环仪器一厂)。

1.4 应用SPSS 11.0软件进行组间t检验,进行差异性比较。

2 试验方法

2.1 细胞培养及处理 按照脾淋巴细胞的提取方法[4]进行细胞悬液的制备,用台盼蓝拒染法进行活细胞的测定,使活细胞数大于95%,调节细胞的浓度为5×106个/mL,分装于培养瓶,试验分5个组,即为空白对照组(为提取的淋巴细胞),药物组(鸦胆子提取物浓度依次为 80μg/mL、120μg/mL、240 μg/mL),每组加脾淋巴细胞悬液3 mL,鸦胆子提取物按所需量加入,在37℃,5%CO2培养箱中分别孵育4 h、8 h、12 h、24 h后。按照试验要求分别收集不同培养时间的细胞及其上清液,备用。

2.2 细胞内cGMP的测定 将备用细胞,调节浓度为1×106个/mL。取 1 mL,1 500 r/min离心5 min,弃去上清液,细胞沉淀加1 mL 50 mmol/L的醋酸缓冲液(pH值4.75),混悬,反复冻融细胞3～4次,3 000 r/min离心15 min,取上清液100μL按照试剂盒操作说明书进行测定。

2.3 细胞内一氧化氮含量的测定(Griess法)[5]在p H值7.5～8.1条件下,溶液中的NO2-可与对氨基苯磺酸发生重氮化,再与N-(1-萘基)-乙二胺偶联,生成紫红色产物,该产物在550 nm存在较大吸收峰。将其在550 nm比色,吸光度值的大小与NO2-的含量或一氧化氮(NO)的产量成正比,据此可检测NO的生成量。

2.3.1 标准曲线制作 以NaNO2为标准,取 0、5、10、25、50、100、160、200、250 μmol/L 浓度梯度作标准曲线,进行标准曲线的测定。

2.3.2 细胞培养4 h、8 h、12 h、24 h后,收集细胞,1 500 r/min离心5 min,取上清液在550 nm处读取吸光度值。根据标准曲线方程计算样品中NO2-的含量。

3 结果

3.1 鸦胆子提取物对细胞内 cGMP的影响 见表1。

浓度为50μg/mL和100μg/mL的鸦胆子提取物组8 h和24 h细胞内cGMP的含量较高,200 μg/mL药物组在12 h开始下降,与空白无差异性。

3.2 鸦胆子提取物提高脾淋巴细胞内的一氧化氮含量结果 见表2。

在表2中,随着鸦胆子提取物浓度的递增,细胞产生的NO的含量在递增,而随着培养时间的延长,细胞产生的NO的含量也在递增,在时间与浓度双因素作用下,细胞产生的NO的含量均呈正相关。

表1 鸦胆子提取物对细胞内cGMP的影响 (pg/10 m L)

表2 鸦胆子提取物对脾淋巴细胞产生NO的影响 (μmol/L)

4 讨论

环核苷酸是重要的细胞内信使物质,它们参与调控各种激素、神经递质等所导致的各种生命活动。cGMP是三磷酸鸟苷(GTP)在鸟苷酸环化酶(GC)作用下水解产生的。NO也可以通过激活鸟苷酸环化酶,导致细胞内 cGMP增加[6]。最新的研究发现,细胞信号转导中存在NO-cGMP通路[7]。NO-cGMP是细胞内NO和cGMP相互作用的机制之一,为了考察鸦胆子提取物对两者的作用,不仅要从单方面研究,而且更重要的是要结合NO-cGMP这一系统机制进行研究。

从鸦胆子提取物对细胞内NO影响结果看,鸦胆子提取物对细胞内NO的产生具有明显的调节作用,不论从培养时间还是药物浓度方面,鸦胆子提取物具有双因子调节功能,并呈时间和浓度的正相关关系。NO可以通过广泛的信号途径来实现其对细胞的功能进行调节,如NO通过MAPK途径启动不同的信号通路,改变机体相应的功能[8];cGMP是NO作用于细胞的主要信号通路[9],低浓度的NO作用于可溶性鸟苷酸环化酶,升高胞间的cGMP,介导PDES,离子通道和蛋白激酶G发挥其相应的生理作用[10]。虽然细胞中NO含量在试验中随着浓度和时间在递增,但存在着一定的活性范围。本试验提示应以cGMP的水平来确定影响NO产生的鸦胆子提取物的浓度。

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