纳米硒对昆明系小鼠的急性毒性及蓄积毒性试验

王 光,王利华,朱连勤

(青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109)

纳米红色元素硒是以蛋白质为分散剂的元素硒的纳米粒子。纳米粒子有不同于宏观和微观物质的特性,纳米红色元素硒粒子中的硒原子比灰色和黑色元素硒有更活泼的化学性质。高学云[1]用粒径在60 nm以内的纳米硒进行试验,急性毒性试验表明,以口服硒元素的量计,纳米红色元素硒的 LD50为112.98(89.95～141.90)mg/kg体重,显示出纳米红色元素硒的低毒性。不同粒度的纳米硒具有不同的尺寸效应,因此不同粒度的纳米硒的毒性不尽相同,作为一种新型的硒源,应充分了解其毒性的基础上才能应用于生产。本试验用昆明系小鼠,研究100 nm纳米硒的LD50、蓄积系数K,为安全使用纳米硒提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 纳米硒的含量为97%以上,直径为100 nm,单分散,无团聚,由山东科技大学惠赠。

1.2 试验动物及饲养 昆明系小鼠购于青岛市实验动物和动物实验中心,生产许可证号为Scxk(鲁)20030010。体重18～22g,雌雄各半,专用的鼠盒饲养,盒底铺设垫料,每3 d更换1次。试验期内自由采食、自由饮水(蒸馏水),采用自然光照,室温26℃～30℃。

1.3 基础日粮配方及营养成分 参考NRC(1974)及GB14924-94配制成纯合日粮见表1。

表1 试验用小鼠基础日粮

1.4 试验方法 半数致死量(LD50)的测定采用改良寇氏法。18～22 g体重的昆明系小鼠50只随机分为5组,每组10只,雌雄各半,分笼饲养,按 0.2 mL/10 g体重限量,一次灌胃,灌注剂量分别为482.04mg ◦kg-1、303.94 mg ◦kg-1、191.64 mg◦kg-1、120.83 mg◦kg-1、76.19 mg◦kg-1(该剂量是根据预试验得到的100%致死量为最高值,按组距等比递减得到的)。灌胃给药前禁食12 h、禁水2 h,灌胃后2 h复食,观察时间为14 d。

在半数致死量的测定结果基础上,采用固定剂量染毒法进行蓄积试验。另取20只健康小鼠,随机分为2组,每组10只,雌雄各半,分笼饲养。按0.2 mL/10 g体重为限量,第1组每鼠每日灌注0.25%羧甲基纤维素溶液;第2组每鼠每日灌服纳米硒1/5 LD50,连续25 d。

1.5 检测指标 在急性毒理学试验中,观察小鼠中毒症状及出现时间。对死亡的小鼠进行剖检,观察心、肝、脾、肺、肾及胃肠的病理变化,取样用 Bouin固定液并制成组织切片,显微镜下观察并记录病理组织学变化。每天称重投料量,次日投料前回称剩料,记录每组小鼠每天的采食量。根据小鼠死亡情况采用改良寇氏公式计算LD50。在蓄积试验中,确定蓄积系数K,并在灌注25 d后做屠宰试验,称量体重及心、肝、肺、脾、肾器官重,并计算内脏器官指数。

1.6 数据统计分析 应用Excel 2003,进行数据的整理与分析,并采用SAS软件中的Glm过程进行方差分析,然后用Duncan氏SSR进行多重比较,检验误差为5%水平。

2 试验结果

2.1 小鼠半致死量 根据表2记录小鼠死亡率可计算出,LD50(小鼠)为303.94 mg/kg,其95%可信限为276.75～391.66 mg/kg。

表2 小鼠灌胃给药急性毒试验结果

2.2 小鼠的采食量变化 各组小鼠平均日采食量变化见图1。

图1 急性浇灌后小鼠的采食量

1组的小鼠在灌注后24 h内的死亡率为100%,因此,没有采食量的记录。2组、3组小鼠采食量的变化趋势相同,即在灌胃后的第1天采食量达到最低,此后逐渐恢复,灌胃后第4天有所下降然后升高。4组、5组小鼠采食量变化趋势大致相同,灌注后采食量逐渐升高,在灌注后第3天出现反弹,之后采食量升高直至正常。

2.3 小鼠中毒症状 中毒小鼠呼吸窘迫,运动失调,个别小鼠表现为蹿行,食欲废绝。死亡小鼠的肛门周围有黄色分泌物。小鼠中毒死亡时间很短,在灌注后1 h内开始出现死亡,48 h后无死亡小鼠。对中毒小鼠进行剖检可见,肝脏有明显的出血;死亡时间拖长的小鼠除肝脏外,心脏及肺脏也偶见有出血,肾脏及脾脏未见异常。

2.4 组织学检查 镜检的结果见中插彩版图2,与正常的组织相比(见中插彩版图3)可见中插肝小叶组织破坏严重,结构紊乱,肝细胞气球样变性严重,坏死较严重,肝窦显著减小,中央静脉严重淤血。肺间质显著增生,肺泡壁显著增厚,肺泡腔明显减小,破裂严重,上皮局灶性坏死。胃小凹处上皮细胞坏死严重,形成局部溃疡灶样病灶。局部肠上皮细胞坏死严重,纹状缘缺失。心肌纤维紊乱,横纹不清,局部肌纤维断裂、坏死、溶解。

2.5 蓄积系数K 1/5LD50固定剂量灌注25 d后小鼠的死亡率。因为累计灌注剂量已达到5LD50,而小鼠的死亡率未达到50%,按规定停止试验,可判断纳米硒的蓄积系数K＞5,属轻度蓄积。

2.6 纳米硒对内脏器官指数的影响 小鼠的内脏器官指数见表3。纳米硒的灌注组与羧甲基纤维素灌注组间各内脏指数无显著差异(P＞0.05)。对肾脏指数的影响在统计上没有达到显著水平,但影响较大(P=0.0792)。性别对脾脏指数的影响显著(P＜0.05),同组雄鼠的脾脏指数均有大于雌鼠的趋势。

表3 25 d 1/5LD50灌注后小鼠内脏器官重及内脏器官指数

3 讨论

本试验通过昆明系小鼠急性试验得到的纳米硒LD50为303.94 mg/kg体重(276.75～391.66 mg/kg体重),蓄积试验得到的蓄积系数K＞5。而亚硒酸钠的 LD50为 15.72(13.38～18.47)mg/kg体重[1],在雏鸡体内的蓄积系数为2.58。本试验的急性毒性试验和蓄积毒性试验均表现出了纳米硒的低毒性。Zhang J S等[2]体外研究证实,纳米硒与GSH的反应速率仅仅是亚硒酸钠与GSH反应速率的1/12.3,这可能是纳米硒毒性较低的机制之一。

本试验所得到的LD50与以往的报道差异较大。王华丽[3]小鼠急性毒性试验表明,纳米硒的LD50值为92.1 mg Se/kg体重,95%的可信限为71.1～131.1 mg Se/kg体重,与高学云[1]报道的相近。造成差异的原因可能是纳米硒尺寸效应的结果,不同的反应体系可生成不同粒度的纳米硒,不同粒度的纳米硒具有不同的理化特性。小粒度的纳米硒可均匀分散于水,本试验所用的纳米硒粒度为100 nm左右,纳米硒易沉淀,颗粒分布不匀,因此试验中无法用水作为纳米硒溶剂而采用0.25%羧甲基纤维素作为悬浮剂,通过增加溶剂的黏度降低纳米硒的沉降速度,以保证纳米硒在溶剂中分布均匀。纳米硒不溶于水,在某种程度上也会减少了机体对硒的吸收,而降低了纳米硒的毒性,在作为添加剂使用时更安全。另外,硒中毒除了硒的形式、动物种类、性别,以及营养因素等影响因素[4],年龄也有很大的影响,本试验采用是机体成熟小鼠,机体代谢相对生长鼠要慢,对纳米硒毒性耐受能力较强,因此而表现出轻度的蓄积。

不同给药方式及不同的动物对硒的毒性的反应不同。本试验小鼠的中毒死亡时间集中在48 h之内。肉仔鸡通过饲料摄入硒的中毒症状会在3至4 d后出现[5]。从急性灌注后小鼠采食量变化可以推断,纳米硒对小鼠一次性非致死量的损伤可在5 d后恢复正常。虽然在灌注2 d后采食量有升高但可以认为是灌胃应激的恢复,5 d之后采食量的恢复正常意味着机体损伤得到恢复。

[1] 高学云,张劲松,张立德.纳米红色元素硒对小鼠的免疫功能的调节作用[J].中国公共卫生,2000,16(5)：421-422.

[2] Zhang J S,Gao X Y,Zhang L D,et al.Biological effects of nano red elemental selenium[J].Bio Factors,2001,15：27-38.

[3] 王华丽.纳米硒的生物利用和毒性研究[D].北京：中国科学技术大学博士学位论文,2007.

[4] Combsg F IR,Combss B.The Role of Selenium in Nutrition[J].British Journal of Nutrition,1986,502-508.

[5] Surai P F.Selenium in poultry nutrition2.Reproduction,egg and meat quality and practical applications[J].World's Poultry Science Journal,2002,58：431-451.