光皮树优良无性系组织培养的无菌体系建立

本玛丽， 王晓明,， 李永欣， 曾慧杰， 蔡 能

(1．中南林业科技大学, 湖南 长沙 410004 2.湖南省林业科学研究院, 湖南 长沙 410004;3.林木无性系育种湖南省重点实验室, 湖南 长沙 410004)

光皮树优良无性系组织培养的无菌体系建立

本玛丽1， 王晓明1,2,3， 李永欣2,3， 曾慧杰2,3， 蔡 能2,3

(1．中南林业科技大学, 湖南 长沙 410004 2.湖南省林业科学研究院, 湖南 长沙 410004;3.林木无性系育种湖南省重点实验室, 湖南 长沙 410004)

以光皮树优良无性系的嫩枝茎段为试验材料，研究不同时期的外植体、灭菌处理与植物激素对接种污染率和无菌外植体得率的影响。结果表明，秋季带顶芽的嫩茎为接种培养的适宜外植体，外植体最佳消毒方法为75%酒精浸泡10s后，用2～3滴吐温80的0.1%升汞溶液消毒7～9min。试验获得了光皮树适宜的初代培养基：MS+6-BA 2.0mg·L-1+NAA 0.05mg· L-1+PVP 300mg·L-1+蔗糖30g·L-1。

光皮树； 组织培养； 污染率； 外植体

光皮树(CornuswilsonianaWanaer)为山茱萸科梾木属落叶灌木或乔木，集中分布于长江流域至西南各地的石灰岩区，黄河及以南流域也有分布[1]。以其果实为原材料制取的生物柴油与0#柴油燃烧性能相似，是一种安全(闪点﹥105)、洁净(灰分﹤0.003)的生物质燃料油[2-3]。开展光皮树种植，发展生物质能源林，具较高的经济、生态与社会效益。湖南省林业科学院已选育出了湘林1～8号早实、高产光皮树优良无性系，并用光皮树油为原料通过脂化工艺制取了生物柴油[4]。在深入研究了光皮树生物学特性和生态习性的基础上，研究出光皮树嫁接繁殖技术，嫁接成活率高达90%，但嫁接繁殖育苗周期长，繁殖系数小，难以满足生物能源林建设对光皮树优良无性系优质种苗的需求，因此，迫切需要开展光皮树的组培快繁技术研究[5]。

目前对光皮树的研究不是很多，王世国等[6]认为光皮树是石灰岩山地造林的良好树种；成训妍[7]、梁仰贞[8]认为光皮树是珍贵的木本食用油料资源；李正茂等[3]提出光皮树油将是一种理想的生物质液体燃料；陈景震等[9]研究了光皮树果实生长发育规律；刑义满等[10]对光皮树油酯化和动力性能进行了综合研究。但至今未见有关光皮树组织培养的研究报道。本文旨在建立光皮树优良无性系组织培养无菌体系，为规模化生产光皮树无性系组培苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1试验材料

本试验以光皮树优良无性系为研究对象。外植体采集于湖南省长沙市天际岭光皮树示范基地5年生光皮树优良无性系G1，分别于春季、夏季和秋季，从当年抽生的新梢上剪取带顶芽或腋芽、无病虫害、无破损、生长旺盛的嫩枝茎段，去掉所有的叶片，当天将采集的嫩枝保湿带回实验室，取顶端4～6cm作为培养材料。

1.2外植体消毒

将采集回的嫩枝，剪去叶片，留叶柄基部，先置于烧杯中，放在自来水下，用流水冲洗约1.5h，用软毛刷蘸洗洁精或洗衣粉溶液轻轻刷洗，自来水冲洗净后，浸泡在洗衣粉溶液10min，用自来水冲洗3～5遍，再用0.1%的百菌清(75%可湿性粉剂，上海升联化工有限公司)溶液中浸泡3min后，用自来水冲洗洁净；将外植体置于超净工作台，用75%酒精浸泡10～20s，无菌水冲洗2～3次,再加含有2～3滴吐温80的0.1%的升汞消毒7～9min，或在0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡15～25min，无菌水冲洗5～8次，用消毒滤纸吸干外植体表面水分[11]。

1.3接种

在无菌条件下接种。将消毒处理了的茎段，切成1.5～2.0cm长。腋芽的芽上茎节部分短一些，芽下茎节部分长一些，将原切口重新切出新的茬口。将消毒后的茎段接种在不同的初代培养基上。原始外植体经接种培养后，当腋芽长至1.5～2.0cm长，剔除发霉和不萌芽的，选取已萌芽的无菌外植体进行继代培养。

1.4培养基及培养条件

以MS为基本培养基，附加成分6-BA、NAA、PVP和活性炭。附加成分按不同的配比加入基本培养基中。培养基含琼脂0.8%，蔗糖3%，pH 5.8。培养基用300mL的广口瓶分装，每瓶30mL，封口膜包扎，在121℃和1.1 kg·cm-2条件下用高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。培养温度为25±2℃，光照1500～2000lx，每日光照时间为12h。

2 试验设计

2.1不同消毒灭菌处理试验

设计6个消毒灭菌处理：75%酒精浸泡10s后，在0.1%升汞(加入2～3滴吐温80)中浸泡7min、8min、9min或在0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡15min、20min、 25min(见表1)。每个处理分别接种100瓶，每瓶接种1 个外植体，每处理顶芽30个，腋芽70个。初代培养基为MS+BA 1.0mg·L-1+NAA 0.05mg·L-1+PVP 300mg·L-1+蔗糖30g·L-1，以不加激素的培养基为对照。接种3d后，若发现细菌感染者，及时剔除，并记录外植体的愈伤组织形成及其萌芽过程。接种30d后，调查外植体的污染率、无菌苗得率，统计外植体萌芽率。

表1 外植体的不同消毒灭菌处理处理编号A1A2A3A4A5A6处理02%的次氯酸钠15min02%的次氯酸钠20min02%的次氯酸钠25min升汞7min升汞8min升汞9min

2.2不同时期的外植体试验

设计4个不同时期的外植体，分别于4月15日、7月23日、9月16日，从当年抽生的新梢上剪取带顶芽或腋芽的健壮嫩枝茎段，带回实验室进行试验。消毒灭菌处理为： 75%酒精浸泡10s后，用0.1%升汞(加入2～3滴吐温80)溶液消毒7～9min。每个处理分别接种100瓶，每瓶接种1个外植体，每处理顶芽30个，腋芽70个。初代培养基为MS+BA 1.0mg·L-1+NAA 0.05mg·L-1+PVP 300mg·L-1+蔗糖30g·L-1，以不加激素的培养基为对照。接种3d后，若发现细菌感染者，及时剔除，并记录外植体的愈伤组织形成及其萌芽过程。接种30d后，调查外植体的污染率、总成活率，统计诱导率。

2.3不同的抗褐变剂及其浓度抑制光皮树组培苗褐变的试验

PVP设计(100mg·L-1、200mg·L-1、300mg·L-1)3种浓度，活性炭设计(100mg· L-1、200mg· L-1、300mg·L-1)3种浓度，将抗褐变剂添加在MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.05mg·L-1培养基中，以不加抗褐变剂的培养基为对照，供试材料为9月份的茎段，每个处理分别接种100瓶，每瓶接种1个外植体。接种30d后，调查外植体的褐变率。

2.4初代培养基适宜的激素配比试验

以消毒灭菌效果最佳的处理(75%酒精浸泡10s后，加入2～3滴吐温80的0.1%升汞溶液消毒7～9min)进行外植体消毒，切取茎段1.5～2.0cm长，接种到MS基本培养基中，附加蔗糖30g·L-1。试验因子为6-BA(0.5，1.0，2.0mg· L-1)、NAA(0.05mg· L-1)的不同水平组合，随机区组设计，共制备3种培养基。外植体为秋季带腋芽的嫩枝茎段,每瓶接种1 个外植体，每处理接种100瓶。

3 结果与分析

3.1不同消毒处理对接种污染率及无菌外植体得率的影响

试验结果(见表2)表明，不同的消毒处理，供试外植体的污染率和无菌外植体得率有差异。从表2还可以看出，不同的季节采样，升汞消毒明显好于0.2%次氯酸钠溶液，延长升汞消毒时间可降低外植体的污染率，但无菌苗得率并没有明显增加。试验结果也说明，升汞消毒时间对降低外植体污染率和提高无菌苗得率的影响不大，光皮树灭菌适宜升汞处理时间为7～9min。

表2 不同消毒处理外植体的污染率和无菌外植体得率(%)处理号A1A2A3A4A5A6污染率897875554336无菌苗得率11011131515

3.2不同时期的外植体对接种污染率及无菌外植体得率的影响

试验结果表明： 9月采取的材料，在接种后7～10d腋芽萌发，25～30d后腋芽萌发率和腋芽长度分别为78.3%和2.2cm，叶片淡绿色，腋芽生长较快。而于4月和7月采取的外植体，在接种后3～4d左右开始褐变，9～10d后褐变非常严重，外植体萎缩或变黑死亡，腋芽没有或很少萌发。

在不同季节剪取外植体，经酒精和次氯酸钠或升汞消毒灭菌后接种在启动培养基上，从其污染情况看，以秋季(9月)剪取的茎段，其无菌苗得率比较高，可达30%，而春季和夏季生长的嫩茎，无菌苗得率均较低，仅有15%(见表3)，这可能与材料本身有关，虽然春季和夏季嫩梢，营养充足，生长旺盛，但因光皮树本身易褐变，太嫩的枝条更甚，不适合灭菌处理，而秋季茎段粗壮，木质化程度相对较高，对灭菌剂的耐受力强，褐变轻，其无菌苗得率较高。

表3 外植体不同剪取时期对无菌苗得率影响的试验结果(%)消毒处理嫩茎春季(4月/15日)夏季(7月/23日)秋季(9月/16日)升汞7min131327升汞8min151530升汞9min151428

秋季嫩枝用0.1%升汞消毒处理8min，外植体萌发也较快，接种于初代培养基后，非染菌芽7d左右就萌发，24d萌芽可长至1.0～1.5cm长；春季、夏季的外植体接种后约10d开始萌芽。试验结果也表明，春、夏、秋三个季节的嫩枝，顶芽萌发比腋芽平均早1～3d左右，接种25d，顶芽萌发的新芽生长量比腋芽的平均高0.5cm。

由此可以确定，光皮树组培快繁初代培养的外植体及其消毒灭菌处理方式，以秋季带顶芽的嫩茎为接种培养的最佳材料，消毒灭菌处理则以75%酒精浸泡10s后，在0.1%升汞中浸泡7～9min为最佳。这与一般植物[7]初代培养时采样时间不一致，可能与光皮树自身的基因型和生理生化状况有关。

3.3不同抗褐变剂及其浓度抑制光皮树组培苗褐变的效果

由表4可以看出，PVP的抗褐变效果明显好于活性炭，添加300mg· L-1PVP的培养基中，组培苗褐变率仅为28%，而添加活性炭300mg· L-1的培养基中，组培苗褐变率高达62%；不加抗褐变物质则所有的试验材料均褐变，说明抗褐变剂在光皮树组织培养过程中非常重要。

表4 不同抗褐变剂及其浓度抑制光皮树组培苗褐变试验结果抗褐变剂处理(mg·L-1)褐变率(%)PVP10036PVP20033PVP30028活性炭10083活性炭20069活性炭30062对照(CK)100

3.4初代培养基的激素配比对诱导外植体萌芽的影响

从表5可看出，光皮树外植体接种在4种培养基中，都可不同程度萌发出新芽。一般接种后4～5d，茎段基部膨大，7～9d后由叶腋处或顶芽陆续长出新芽，30d后可伸长到1.1～1.6cm。在4号培养基 (MS+6-BA 2.0mg· L-1+NAA 0.05mg· L-1+PVP 300mg· L-1) 上每个外植体平均萌发芽数最多，为1.69，其萌发新芽的生长情况较好；而在1号培养基(MS+6-NAA 0.05mg· L-1)上每个外植体平均萌发芽数最少，仅为0.82。这说明光皮树初代培养基中不宜单独附加NAA，应添加一定浓度6-BA，且适当提高6-BA浓度可促进外植体萌芽。

表5 初代培养基的不同激素配比试验结果处理附加成分6—BANAA外植体平均萌芽数(个)苗均高(cm)100005082110205005138143310005153135420005169128

4 结论

在光皮树无性系组织培养无菌体系建立的试验中，不同的消毒处理、不同时期及不同类型的外植体对其污染率和无菌外植体得率存在差异。研究结果表明，初代培养的外植体以秋季带顶芽的嫩茎为接种培养的最佳外植体，适宜的外植体消毒灭菌处理方法为：75%酒精浸泡10s后，用含2～3滴吐温80的0.1%升汞溶液消毒7～9min。

初代培养基的激素配比对诱导外植体萌芽及其生长有影响。光皮树优良无性系适宜初代培养基为MS+6-BA 2.0mg·L-1+ NAA 0.05mg· L-1+PVP 300mg· L-1+蔗糖30g·L-1。

[1] 谢红梅，李华.光皮树播种育苗技术[J].农村实用技术,2008，6：44.

[2] 李昌珠,蒋丽娟,程树棋.生物柴油研究现状与商业化应用前景[C]//中国生物质能技术研究会论文.南京,2002.

[3] 李正茂,邓新华,李党训.光皮树经济性状及生物质液体燃料开发研究构想[J].湖南林业科技，1996,23(2):11-13.

[4] 李昌珠,赵江红.生物油料能源树种光皮树[J].湖南林业,2007(2):18.

[5] 李党训,李昌珠,陈永忠,等.植物燃料油原料树种光皮树繁殖技术的研究[J].林业科技开发,2005,19(3):33-35.

[6] 王世国,高培演,张群.光皮树播种育苗试验[J].安徽农业科学,2007,35(14):4172.

[7] 成训妍.光皮树是珍贵的木本食用油料资源[J].生物与特产,1990(6):28.

[8] 梁仰贞.光皮树栽培技术[J].经济植物，2007,3(2):37-39.

[9] 陈景震，李昌珠，肖志红，等.光皮树果实生长发育规律研究[J].湖南林业科技，2008，35(1)：4-5.

[10] 刑义满,蒋崇林.光皮树油酯化制取生物柴油的中试研究[J].新能源，1997，19(4)：38-40.

[11] 王晓明,易霭琴,宋庆安,等. 灰毡毛忍冬新品种组织培养无菌体系的建立[J].经济林研究，2005，23(4)：14-16.

(责任编辑：谭著明)

GermfreesystemestablishmentoftissueculturefromthesuperiorcloneofCornuswilsoniana

BEN Mali1, WANG Xiaoming1,2,3, LI Yongxin2,3, ZENG Huijie2,3, CAI Neng2,3

(1.Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China; 2.Hunan Forestry Academy,Changsha 410004, China; 3.Hunan Key Laboratory of Trees Clones Breeding Technology, Changsha 410004, China)

Taken young stem segments of the superior clone ofCornuswilsonianaas experimental materials, the effects of different explants, sterilization treatment and phytohormone on pollution rate and germfree explants rate were researched. The results showed that the suitable explants were the segments of young stem with terminal bud in autumn. And the optimum explants sterilization method was to dip in 75% alcohol for 10s, then in 0.1% HgCl2with 2～3 drops tween-80 for 7～9min. The suitable medium for primary culture ofCornuswilsonianawas MS+6-BA 2.0mg·L-1+NAA 0.05mg·L-1+PVP 300mg·L-1+sucrose 30g·L-1.

Cornuswilsoniana; tissue culture; pollution rate; explants

2010-02-24

2010-03-15

国家“十一五”科技支撑计划《林木优质种苗快繁技术研究与示范推广》(2008BADB7B03)

本玛丽(1984-)，女，湖南省郴州市人，硕士研究生，从事经济林育种与栽培研究。

S 722.3+7

A

1003-5710(2010)02-0005-03