无溶剂直接酯化法合成α-亚麻酸植物甾醇酯工艺研究

张 品 邓乾春 黄庆德 黄凤洪

(中国农业科学院油料作物研究所,武汉 430062)

无溶剂直接酯化法合成α-亚麻酸植物甾醇酯工艺研究

张 品 邓乾春 黄庆德 黄凤洪

(中国农业科学院油料作物研究所,武汉 430062)

研究了植物甾醇与α-亚麻酸无溶剂直接酯化法合成α-亚麻酸植物甾醇酯的最佳工艺条件。通过单因素试验研究了α-亚麻酸和植物甾醇不同质量比、催化剂添加量、反应时间及反应温度对α-亚麻酸植物甾醇酯酯化率的影响。通过正交试验对α-亚麻酸植物甾醇酯合成工艺进行优化,最终得到优化工艺条件为:即真空度为 0.03～0.04 MPa,α-亚麻酸与植物甾醇的质量比4∶1,催化剂量为 2.5%,反应时间为 8 h,反应温度 140℃,在此条件下,α-亚麻酸植物甾醇酯的酯化率为 (98.88±0.984)%。因此,通过本论文的研究得到了一种绿色、安全、高效的α-亚麻酸植物甾醇酯合成工艺。

植物甾醇 α-亚麻酸 直接酯化 α-亚麻酸植物甾醇酯

植物甾醇是一种存在于植物体内的天然活性物质,其结构与动物体内的胆固醇相似[1]。至今已发现有 100多种植物甾醇,含量较丰富的主要有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇[2-3]。植物甾醇主要是通过抑制膳食和胆汁中的胆固醇在肠道内的吸收从而达到降低胆固醇的功效[2,4-5]。除此之外,植物甾醇还具有抗癌、抗氧化[2,6]、抗动脉粥样硬化[7]和抗炎[8]等功效,被应用于制药、保健品和化妆品等工业中[1]。但是,结晶形式的植物甾醇在人体内的溶解性和生物利用性比较差;并且植物甾醇的疏水性和油溶性较差造成了使用上的困难[9-10]。α-亚麻酸是 9c,12c,15c-十八碳三烯酸,为人体必需的多不饱和脂肪酸,对人体具有不可缺少的生理活性。α-亚麻酸是合成二十碳五烯酸 (EPA)、二十二碳六烯酸 (DHA)的前体物质,具有降血脂、降胆固醇、促进脂肪代谢和肝细胞再生[11]、抗过敏[12]、抗癌[13]等作用,但是其分子中存在三个共轭双键,极易被氧化。油溶性与稳定性均佳的植物甾醇脂肪酸酯合成工艺的出现使这些难题得以解决[14],植物甾醇脂肪酸酯可以替代植物甾醇添加到各种食品中并且不改变产品的最终风味,且能增加产品生物活性,如植物甾醇亚油酸酯、植物甾醇油酸酯等[15-17]。但目前缺乏对α-亚麻酸植物甾醇酯合成工艺的系统研究,现有工艺也存在经济成本高和副产物较多等问题[15-16],本文采用植物甾醇与α-亚麻酸直接酯化的方法合成α-亚麻酸植物甾醇酯,通过正交试验对酯化反应条件进行了优化,以期得到一种绿色合成工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物甾醇 (总质量分数 95%,其中含β-谷甾醇77%,菜籽甾醇 17%,豆甾醇 5%,菜油甾醇 1%):西安蓝天生物工程有限公司;α-亚麻酸 (80%):河南利诺生化有限责任公司。

Agilent 6890气相色谱仪:美国 Aglient公司;AS600型核磁共振仪:美国瓦里安公司。

1.2 试验方法

1.2.1 α-亚麻酸植物甾醇酯的合成方法

在 50 mL锥形瓶中加入一定比例的α-亚麻酸、植物甾醇和催化剂,置于空气摇床上振摇 30 min后,在真空度为 0.03～0.04 MPa,一定温度条件下反应。反应结束后,水洗 3次去除催化剂,无水硫酸钠干燥即得α-亚麻酸植物甾醇酯粗产品。将α-亚麻酸植物甾醇酯粗产品加热至 100℃熔融后,加入 5%～10%活性白土,在抽真空条件下 110℃搅拌 1～2 h后,过滤,得到淡黄色、可在 30℃以上自由流动的、黏稠状流体。

1.2.2 酯化率的测定[16,18]

气相色谱条件为:DB-5HT型石英毛细管色谱柱 (15.0 m ×320μm ×0.10μm),FI D检测器;进样量为 1.0μL,高纯 N2为载气,进样口温度 350℃,检测器温度 350℃,恒压模式;分流比10∶1,H2流量为40.0 mL/min,空气流量为 400 mL/min,尾吹气 N2流量为 30 mL/min。程序升温初温 180℃,以20℃/min升至 230℃,保持 0.5 min;再以 5℃/min的速率升至 260℃,保持 0.5 min;然后以 30℃/min的速率升温至 320℃,保持 0.5 min;最后以10℃/min的速率升温至 380℃,保持 3 min。

通过 GC图谱中各组分的峰面积计算α-亚麻酸植物甾醇酯的酯化率 (DE),如公式 (1)

式中:A为植物甾醇的总峰面积;B为α-亚麻酸植物甾醇酯的峰面积;1.629为植物甾醇与α-亚麻酸植物甾醇酯的转换系数。

1.3 单因素试验

以α-亚麻酸植物甾醇酯酯化率为指标,选取原料质量比 (α-亚麻酸:植物甾醇)、催化剂用量、反应温度、反应时间 4个影响合成工艺效果因素做单因素试验,确定各因素的合适范围。

1.4 正交试验

为了减少试验次数,探索各因素对α-亚麻酸植物甾醇酯酯化率的影响,确定工艺条件,在前期单因素分析结果基础上,采用正交试验法进行四因素三水平的正交试验。

1.5 α-亚麻酸植物甾醇酯的薄层色谱分离[15]

将粗产品经过薄层色谱进一步分离,展开剂为石油醚 (60～90 ℃),乙醚 ∶乙酸 (90∶10∶1,v∶v∶v),碘蒸气为显色剂,并与反应底物α-亚麻酸和植物甾醇进行比较。

1.6 核磁共振谱仪分析[19]

按 1.6方法对产品进行分离以后,将α-亚麻酸植物甾醇酯展开部分小心刮下,用 CDCl3溶剂浸泡约 20 min,待硅胶层呈现白色后进行离心,取上层溶剂通过核磁共振谱仪对α-亚麻酸植物甾醇酯进行1H谱和13C谱的分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 反应体系和催化剂的选择

在真空度为 0.03～0.04 MPa,原料质量比为3∶1,催化剂用量为反应原料质量的 2%,反应温度130℃,反应温度为 6 h条件下,分别选取甲醇钠、氯化钾、柠檬酸、硫酸氢钠、乙酸钠、苯甲酸钠、无水亚硫酸钠、氢氧化钙、氢氧化钠、氧化镁、氧化钙、氧化镧及其复合催化剂对反应进行催化,不同催化剂对α-亚麻酸植物甾醇酯酯化率的影响如表 1所示。结果表明,使用硫酸氢钠作为催化剂时的酯化率最高,产品颜色较浅,并且水溶性的硫酸氢钠在反应后也容易除去,不会在最终产品中残留。孟祥河等[20]的研究发现当氧化镁、氧化钙、氧化镧以一定配比复合后催化效果明显提高,试验所得数据与其相似,但是在相同条件下,硫酸氢钠的催化效果要优于这种复合催化剂;如果使用复合催化剂,必须进一步提高反应温度才能使酯化率达到 90%以上,这就有可能导致副产物的产生。故选择硫酸氢钠为催化剂。

由于酯化与水解是可逆的化学平衡反应,为使酯化进行完全,可以采用两种方法:(1)原料配比中,使便宜原料过量以提高平衡时酯化率;(2)通过不断蒸发去除反应生成的酯和水。由于植物甾醇沸点高,可在反应体系内加入甲苯或者二甲苯,作为反应溶剂和带水剂,利用分水器去除反应生成的水。但是考虑到甲苯和二甲苯对人体及环境存在一定的危害,所以采用过量α-亚麻酸既做反应物又充当反应溶剂,在一定的真空度下去除反应生成的水。

2.1.2 原料质量比对酯化率的影响

表 1 不同催化剂催化合成α-亚麻酸植物甾醇酯的酯化率

采取添加α-亚麻酸过量来促进反应的进行。在真空度为 0.03～0.04 MPa,催化剂用量为反应原料质量的 2%,反应温度 130℃,反应时间为 7 h条件下,反应原料质量比对α-亚麻酸植物甾醇酯酯化率的影响如图 1所示。从经济角度考虑,期望等物质的量的反应底物可以完全反应,但是在实际操作中这并不是理想的条件,当等物质的量的α-亚麻酸和植物甾醇反应 7 h后其酯化率只在 65%左右。

图 1 原料质量比对酯化率的影响

结果表明,随着α-亚麻酸添加量的增大,酯化率迅速增大,当α-亚麻酸 ∶植物甾醇质量比为4∶1时,酯化率达到最大值,再继续增大α-亚麻酸添加量,酯化率反而降低。Villeneuve P.等[15]在研究植物甾醇油酸酯的合成时,也发现了类似的情况。当质量比为5∶1和6∶1时,酯化率反而下降。这种情况可以由硫酸氢钠的催化机理来解释。硫酸氢钠催化酯化反应机理是硫酸氢根电离出的氢离子极化羰基中的O,增强羰基 C受亲核试剂进攻的能力。随着α-亚麻酸质量的增加使得催化剂在整个体系中的浓度下降,氢离子无法很好的作用于羰基 O和 C,从而导致酯化率下降。另一方面,也有可能是α-亚麻酸发生了自身的缩合反应而影响了酯化率。李瑞等[17]在利用有机相脂肪酶催化合成共轭亚油酸β-谷甾醇酯时,当酸醇物质的量比为1∶1时酯化率达到最高,当物质的量比逐渐增大,酯化率呈递减趋势。故选择原料质量比为4∶1。

2.1.3 反应温度对酯化率的影响

在真空度为 0.03～0.04 MPa,原料质量比为4∶1,催化剂用量为反应原料质量的 2%,反应时间7 h,反应温度对α-亚麻酸植物甾醇酯酯化率的影响如图 2所示。从图 2可以看出,在温度低于 100℃时,酯化率很低,这主要是由于植物甾醇在 100℃以下不能熔融,无法与α-亚麻酸充分接触,导致反应迟缓;为了使反应较快进行,可预先加热植物甾醇后再加入α-亚麻酸和催化剂。当温度高于α-亚麻酸后,产品的酯化率随着温度的升高而急速增加,但到了 130℃以后,酯化率增加的幅度变小,特别是从150℃增加到 180℃增加的幅度更小。升温能提高反应速率,但随着温度的升高,产品颜色逐渐加深,影响最终产品的应用。陈茂彬等[21]在研究反应温度对合成植物甾醇油酸酯的影响时,同样发现当反应温度大于 135℃以后,酯化率增加的幅度减小。α-亚麻酸含有三个双键,如果反应温度过高容易被氧化,所以反应温度应控制在 150℃以下为宜。

图 2 反应温度对酯化率的影响

2.1.4 催化剂添加量对酯化率的影响

在真空度为 0.03～0.04 MPa,原料质量比为4∶1,反应温度 130℃,反应时间 7 h,催化剂用量对α-亚麻酸植物甾醇酯酯化率的影响如图 3所示。由图 3可见,随着催化剂用量的增加,酯化率显著增加,但超过 2%以后增加幅度变缓,并且随着催化剂量的增加,产品颜色变深。硫酸氢钠在催化植物甾醇油酸酯合成时也呈现相似的规律[21]。所以催化剂用量以底物质量的 2%为优。

图 3 催化剂添加量对酯化率的影响

2.1.5 反应时间对酯化率的影响

在真空度为 0.03～0.04 MPa,原料质量比为4∶1,催化剂用量为反应原料质量的 2%,反应温度130℃,反应时间对α-亚麻酸植物甾醇酯酯化率的影响如图 4所示。很多研究发现反应时间越长,酯化率越高[15,17,21-23]。α-亚麻酸植物甾醇酯的酯化率随着反应时间的延长而升高,特别是在反应开始的 8 h内升高趋势显著;当在继续延长反应时间时,升高趋势趋于平缓。从经济角度考虑,反应时间应限制在一定的范围内,反应时间过长也可能导致副反应的发生、副产物的生成,故最佳反应时间选择 8 h。

图 4 反应时间对酯化率的影响

2.2 反应条件优化

为了探索各个因素对α-亚麻酸植物甾醇酯酯化率的影响,确定最佳工艺条件,根据单因素试验结果,正交试验选择原料质量比 (α-亚麻酸:植物甾醇)、催化剂添加量、反应时间和反应温度作为考察因素,采用正交试验法设计试验方案 (见表 2)。正交试验结果见表 3。

通过表 3分析结果可见,影响酯化率的因素主次顺序为:D>C>A>B,其中反应温度 (D)是影响酯化率最主要因素,由单因素试验结果也可知,温度升高,有利于酯化反应进行,但是温度不宜太高,因为温度过高可能会发生副反应,如双键被氧化,甾醇分子内脱水等,影响产品质量。结果表明,反应温度选择 140℃比较合适。其次,影响酯化率的因素为反应时间 (C),延长反应时间,有利于酯化反应的进行,但是在单因素试验时发现,再延长反应时间酯化率的增加幅度变小,所以选择 8 h为反应时间。再次,原料质量比 (A)对酯化率也有一定的影响,添加过量的α-亚麻酸能促使反应的进行,当原料质量比为 4 ∶1和 5 ∶1时 ,极值没有变化 ,考虑到经济性 ,选取4∶1为原料配比的最佳比例。催化剂添加量 (B)对酯化反应的影响最小,当催化剂添加量为 2.5%时,酯化率较高。所以,综合试验结果和工艺的经济可行性,选取条件A2B3C2D2时能得到具有高产率和低成本的工艺条件,即α-亚麻酸与植物甾醇的质量比4∶1,催化剂量为 2.5%,反应时间为 8 h,反应温度140℃。在最佳反应条件下进行验证试验,得到酯化率为 (98.88±0.98)%。与陈茂彬等[21-22]优化的植物甾醇油酸酯和植物甾醇硬脂酸酯的工艺条件相比,本试验所用α-亚麻酸较多,采用真空技术也可以使α-亚麻酸受到保护,不易被氧化;同样条件下,酯化率有所提高。

表 2 因素水平表

表 3 正交试验安排及试实验结果

2.3 α-亚麻酸植物甾醇酯的薄层色谱分离

按照 1.6方法对得到的α-亚麻酸植物甾醇酯粗产品进行薄层色谱分离,结果显示,分离效果良好,有新物质α-亚麻酸植物甾醇酯的生成。其中,新生成的α-亚麻酸植物甾醇酯的颜色比α-亚麻酸和植物甾醇的颜色要深,表明通过直接酯化法得到的产品中含有较高含量的α-亚麻酸植物甾醇酯。α-亚麻酸植物甾醇酯的 Rf值为 0.90,与文献报道相符[24]。

2.4 α-亚麻酸植物甾醇酯的核磁共振谱仪分析

由α-亚麻酸植物甾醇酯的 1H谱图可知,分析样品中含有烯氢 (δ=4.5～6.5)和芳氢 (δ=6～8),不含醛氢 (δ=9～10)、羟基氢 (δ=10～13)和烯醇氢(δ=11～16),说明样品中不含有机酸、醛和烯醇。由13C谱图可知,样品中含有叔酯碳 (δ=60～75)而不含羧酸酯碳 (δ=155～175)、羧酸碳 (δ=160～185)和醛碳 (δ=175～205)。通过对样品进行核磁共振谱仪分析,结合前人研究可初步推断α-亚麻酸与植物甾醇酯化的位点是在植物甾醇六元环的一个羟基碳上,酯化后,羟基碳转变成叔酯碳;也进一步证实了反应产物为α-亚麻酸植物甾醇酯[19]。

3 结论

以植物甾醇与α-亚麻酸为原料,硫酸氢钠为催化剂,在对α-亚麻酸植物甾醇酯合成单因素试验的基础上,利用正交试验确定了无溶剂直接酯化法合成甾醇酯的最优工艺条件;正交试验筛选出的最佳反应条件为:真空度为 0.03～0.04 MPa,硫酸氢钠添加量为 2.5%(底物质量),α-亚麻酸与植物甾醇的质量比为4∶1,反应温度 140℃,反应 8 h,酯化率可达 98%;所得条件温和易操作,且由于在整个工艺中无任何有机溶剂和有毒有害物质的引入,是一种安全、无污染的食品级绿色工艺。

植物甾醇酯作为一种降胆固醇和降血脂的功能性食品添加剂,可以广泛应用于食品、医药、化妆品等行业中,但是其开发和应用在我国才刚刚起步。α-亚麻酸植物甾醇酯作为一种新的甾醇酯产品,在得到切实可行的合成工艺后,下一步还需对其结构特性和生物活性等方面进行全面的研究。

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Synthesis of PhytosterolsLinolenate byDirect Esterification without Solvent

Zhang Pin Deng Qianchun Huang Qingde Huang Fenghong
(Institute ofOil Crop of CAAS,Wuhan 430062)

A method of synthesizing phytosterols linolenate by direct esterification of phytosterols andα -linole2 nic acid without solventwas studied.The influencing factorswere studied by single factor tests,such asmass ratio,catalyst dose,reaction time and temperature.Through orthogonal test,the opti mal synthetic conditions were con2 firmed as follows:vacuum 0.03～0.04 Mpa,mass ratio ofα -linolenic acid to phytosterols 4∶1,catalyst dose 2.5%of raw materialweight,reaction temperature 140℃,and reaction ti me 8h.Under these conditions,the degree of esterification is up to(98.88±0.984)%.The developed process for synthesizing phytosterols linolenate could be considered as green,safe and highly efficient.

phytosterol,α -linolenic acid,direct esterification,phytosterols linolenate

TQ645.9+8

A

1003-0174(2010)01-0055-06

中国农业科学院油料作物研究所所长基金(2007-17)

2009-01-23

张品,女,1984年出生,硕士,功能食品与生物活性物质

黄凤洪,男,1956年出生,研究员,博士生导师,油料加工与营养研究