响应面法优化大豆肽与钙离子螯合的研究

孙莉洁 梁金钟,2

(东北林业大学林学院1,哈尔滨 150040)

(哈尔滨商业大学食品工程学院2,哈尔滨 150076)

响应面法优化大豆肽与钙离子螯合的研究

孙莉洁1梁金钟1,2

(东北林业大学林学院1,哈尔滨 150040)

(哈尔滨商业大学食品工程学院2,哈尔滨 150076)

为优化大豆肽 -钙的螯合工艺,在单因素的基础上,应用响应面法对大豆肽与氯化钙的混合质量比、水浴时间以及无水乙醇添加倍数之间的交互作用进行试验探讨并确立了最佳水平。研究结果表明:无水乙醇添加倍数显著地影响了大豆肽 -钙螯合效果,混合质量比、水浴时间次之,优化的最佳条件为:混合质量比4.2∶1,水浴时间 21.3 min,无水乙醇添加 6倍,在此条件下,大豆肽 -钙的得率为 65.4752%,钙质量比为7.74 g/(100 g大豆肽 -钙产品)。大豆肽与大豆肽 -钙的傅里叶变换红外光谱对照结果显示:在大豆肽 -钙的螯合工艺中,氨基与羧基均参与了螯合反应。

大豆肽 螯合钙 工艺 响应面法

国内外的调查结果表明,钙缺乏相关性疾病是长期缺钙的结果[1]。无论是老人还是儿童,缺钙几乎是全球性的营养问题[2]。尤其对孕期妇女而言,钙、镁等微量营养素的补充对胎儿的生长发育非常必要[3]。因此,在提高膳食中对钙的吸收利用率之外,寻求更高效的补钙制剂亦是解决缺钙问题的有效途径。

国外已有学者对钙调蛋白[4-5]和具有一定序列的肽之间的作用机理进行了系统研究,为我们提供了宝贵的经验。大豆肽可与钙、锌、铜、镁、铁等金属离子和微量元素形成络合物,保护一些金属离子和人体所必需的微量元素不被植酸、草酸、单宁所沉淀,并使微量元素处于良好的可溶状态,有利于被机体吸收,显著促进钙、磷等矿物质和其他微量元素的吸收[6-7]。同时,大豆肽营养价值高,易于被人体吸收。因此,大豆肽 -钙螯合物在理论上拥有双重的营养价值:在补充优质氮源的同时,更促进了人体对钙质的吸收。本试验采用微生物发酵法生产制得的大豆肽作为原料与氯化钙进行螯合,方法简便可取,对钙的螯合效果较好,并且改变了大豆肽的不良气味。

1 材料和方法

1.1 试验材料

大豆肽粉:哈尔滨乐能生物工程有限股份公司。

无水乙醇:分析纯,天津市东丽区天大化学试剂厂;高锰酸钾、浓硫酸:分析纯,天津市耀华化学试剂有限责任公司;甲基红:分析纯,天津市光复精细化工研究所;草酸铵、无水氯化钙:分析纯,天津市博迪化工有限公司;氨水:分析纯,哈尔滨理工化学试剂有限公司;盐酸:分析纯,哈尔滨市新达化工厂。

1.2 试验仪器及设备

ALC-210.2型电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司;JA2003型电子天平:上海良平仪器仪表有限公司;DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱:上海一恒科学仪器有限公司;HHS型电热恒温水浴锅:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;PHS-3C型精密pH计:上海雷磁仪器厂;Magna-IR 560 E.S.P型傅里叶变换红外光谱仪:美国尼高力 (Nicolet)公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆肽 -钙螯合工艺流程

大豆肽粉→一定量蒸馏水溶解→加入不同量的氯化钙→调节 pH→混匀→水浴并搅拌→无水乙醇沉淀→离心→沉淀洗涤→鼓风干燥→大豆肽 -钙

1.3.2 钙的测定

采用高锰酸钾滴定法[8]进行测定。

1.3.3 钙质量比计算公式

KMnO4KMnO4为滴定消耗的高锰酸钾的体积/L;MCa=40 g/mol;ms为大豆肽 -钙的质量/g

1.3.4 大豆肽 -钙得率计算公式

式中:ms为大豆肽 -钙质量 /g;C大豆肽=50 g/L;V大豆肽为每次试验添加大豆肽液的体积 /L;C氯化钙=100 g/L;V氯化钙为每次试验添加氯化钙的体积 /L。

1.3.5 单因素试验

将 50 g/L的多肽溶液与 100 g/L氯化钙按一定质量比进行混合,调节 pH,充分搅拌使其混匀,在一定温度条件下水浴保持一定时间,随后加入合适体积的无水乙醇,离心、鼓风干燥得到大豆肽 -钙,称重。称取0.2～0.3 g大豆肽 -钙按照高锰酸钾滴定法测定其中的钙质量比,通过大豆肽 -钙得率和钙含量两个指标来衡量和确定最佳的螯合工艺,并通过响应面法进一步优化试验设计。

1.3.6 大豆肽 -钙螯合物结构的初步分析

采用傅里叶变换红外光谱法进行螯合物结构的初步分析:取少量试样,加入 KBr做稀释剂,在玛瑙研钵里研磨至粒子细小而均匀,压片成型。用傅立叶变换红外光谱仪测试,分辨率设置为 4 cm-1,扫描次数 40次。

2 试验结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 大豆肽与氯化钙的混合质量比例对大豆肽-钙得率的影响

将 50 g/L的多肽溶液与 100 g/L氯化钙按质量比1∶1、2∶1、1∶3、1∶4、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1进行混合 ,调节至 pH 7.0,充分搅拌使其混匀,在 50℃下水浴保持 30 min,随后加入 8倍于混合液体积的无水乙醇,离心、鼓风干燥得到大豆肽 -钙,称重。称取0.2～0.3 g大豆肽 -钙按照高锰酸钾滴定法测定其中的钙质量比,通过大豆肽 -钙的得率和钙质量比两个指标来确定最佳的混合比例。

图 1 大豆肽与氯化钙的混合质量比对大豆肽 -钙得率的影响

如图 1所示,大豆肽 -钙得率、钙质量比两组曲线的变化趋势基本一致。当大豆肽与氯化钙质量比达到4∶1时,大豆肽 -钙得率达到最大值,此时,每100 g大豆肽 -钙产品中的钙质量比也达到最大。可以认为,此时大豆肽与氯化钙可以比较充分地螯合,因此选择混合比4∶1作为最佳的混合比值。

2.1.2 pH对大豆肽 -钙得率的影响

将 50 g/L的多肽溶液与 100 g/L氯化钙按质量比4 ∶1进行混合 ,调节 pH分别为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,充分搅拌使其混匀 ,在 50 ℃下水浴保持 30 min,随后加入 8倍于混合液体积的无水乙醇,离心、鼓风干燥得到大豆肽 -钙,称重。称取 0.2～0.3 g大豆肽 -钙按照高锰酸钾滴定法测定其中的钙质量比,通过大豆肽 -钙的得率和钙质量比两个指标来确定最佳的 pH。

图 2 pH对大豆肽 -钙得率的影响

如图 2所示,在 pH从 1到 7的改变中,两组曲线的变化均比较大,但基本趋势依然一致。在酸性条件下,大豆肽会发生部分解离,使得和钙反应的-COO-增加,pH 5.5时达到较大值。随着 pH的增大,解离慢慢变弱,部分大豆肽通过吸附作用与钙结合[9],从而使得大豆肽 -钙得率在 pH 6.5时达到最大值。而在偏碱性或者碱性条件下,会产生Ca(OH)2,从而会影响大豆肽与钙的螯合,因此,本试验不研究碱性条件下的螯合。此单因素试验结果表明,pH 6.5可以作为后续研究的最佳参数。

2.1.3 水浴温度对大豆肽 -钙得率的影响

将 50 g/L的多肽溶液与 100 g/L氯化钙按质量比4∶1进行混合,调节至 pH 6.5,充分搅拌使其混匀,分别在 30、40、50、60、70 ℃下水浴保持 30 min,随后加入 8倍于混合液体积的无水乙醇,离心、鼓风干燥得到大豆肽 -钙,称重。称取 0.2～0.3 g大豆肽 -钙按照高锰酸钾滴定法测定其中的钙质量比,通过大豆肽 -钙的得率和钙质量比两个指标来确定最佳的水浴温度。

图 3 水浴温度对大豆肽 -钙得率的影响

从图 3可知,两组曲线的变化趋势一致,而且随着温度的升高,均没有大幅的变化。即说明大豆肽-钙螯合反应中,温度对大豆肽 -钙得率影响不大。在后续试验中,选择 50℃作为最佳的反应温度。

2.1.4 水浴时间对大豆肽 -钙得率的影响

将 50 g/L的多肽溶液与 100 g/L氯化钙按质量比4∶1进行混合,调节至 pH 6.5,充分搅拌使其混匀,在 50 ℃下分别水浴保持 0、10、20、30、40、50 min,随后加入 8倍于混合液体积的无水乙醇,离心、鼓风干燥得到大豆肽 -钙,称重。称取 0.2～0.3 g大豆肽-钙按照高锰酸钾滴定法测定其中的钙质量比,通过大豆肽 -钙的得率和钙质量比两个指标来确定最佳的水浴时间。

图 4 水浴时间对大豆肽 -钙得率的影响

水浴时间对大豆肽 -钙得率的影响如图 4所示。由图 4可知,在水浴时间 20 min时,大豆肽 -钙得率和钙质量比均达到最大值。这是因为通过吸附作用而产生的大豆肽 -钙随着反应的进行发生着动态的吸附和解析过程,20 min时达到动态平衡。因此在后续试验中,选择反应时间 20 min作为最佳的参数。

2.1.5 无水乙醇添加量对大豆肽 -钙得率的影响

将 50 g/L的多肽溶液与 100 g/L氯化钙按质量比4∶1进行混合,调节至 pH 6.5,充分搅拌使其混匀,在 50℃下水浴保持 20 min,随后分别加入 4、6、8、10、12倍于混合液体积的无水乙醇,离心、鼓风干燥得到大豆肽 -钙,称重。称取 0.2～0.3 g大豆肽 -钙按照高锰酸钾滴定法测定其中的钙质量比,通过大豆肽 -钙的得率和钙质量比两个指标来确定最佳的无水乙醇添加量。

图 5 无水乙醇添加倍数对大豆肽 -钙得率的影响

无水乙醇的添加量对大豆肽 -钙得率的影响如图 5所示。不同的乙醇添加倍数对大豆肽 -得率以及钙质量比的影响都比较大。当无水乙醇体积是混合液体积的 6倍时,两者都达到最大值。这是因为,乙醇添加量过少,沉淀不够充分,添加量过多,又会破坏大豆肽与钙的结合,乙醇和氯化钙反应生成CaCl2·4C2H5OH,因此,适当的添加量对大豆肽 -钙的影响也很大,在后续试验中,选择 6倍于混合液体积的无水乙醇添加量作为最佳参数。

2.2 响应面法优化试验设计结果与分析

根据 Box-Benhnken的中心组合试验设计原理[10],综合单因素的试验结果,选取大豆肽与氯化钙的混合质量比、水浴时间、无水乙醇添加倍数进行三因素三水平的响应面分析试验,表 1为响应面因素水平设计。表 2为响应面回归试验设计与试验结果。

表 1 响应面因素水平设计

表 2 响应面设计与试验结果

试验编号 1～12是析因试验,试验编号 13～15是中心试验。15个试验点分为析因点和零点,其中析因点为自变量取值在 x1、x2、x3所构成的三维顶点上;零点为区域的中心点,零点重复 3次,以估计试验误差。应用统计软件 SAS-RSREG程序对表 2中所得数据进行多元回归拟合分析,二次多元回归方程为:

Y=0.648 466 67+0.041 850 00x1+0.000 667 50x2+0.002 150 00x3-0.067 983 333x1x1+0.003 550 00x2x1-0.013 933 3x2x2+0.008 550 00x3x1-0.000 350 00x3x2-0.026 483 33x3x3

对该方程的方差分析结果见表 3,回归系数显著性检验结果见表 4,方程的验证结果见表 5,响应面图和等高线图分别见图 6～图 8。

表 3 回归方程方差分析

从表 3可以看出,用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时,各因素中一次项和二次项比较显著,但交叉项不显著。因此,各具体试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。响应面的模型总离差平方和为 0.001 397。3个因子对 Y的效应有一次项、二次项和交叉项。由 R=0.980 5、R2=0.961 3可以得出此模型的符合度为 96.13%,模型拟合大豆肽 -钙螯合得率与 3个因子的关系确立。

表 4 回归系数显著性检验和结果

从表 4可以看出,回归方程对试验拟合较好,方差分析结果较显著,因此可用回归方程代替试验值进行分析。

表 5 方程检验结果方差分析

由表 5中检验结果的方差分析表明,P值为0.952 8,检验结果与模型计算结果没有显著差异。

图 6 Y=f(x1,x2)的响应面及等高线

图 6～图 8反映了各因素对响应值的影响。从等高线图可以看出,极值条件应在圆心处。比较 3组图可知,无水乙醇添加倍数 (x3)是影响大豆肽 -钙得率的最显著因素,混合比 (x1)和水浴时间 (x2)次之,说明 x1、x2对响应值影响相对较小。

由图 6～图 8可以看出,大豆肽 -钙得率随无水乙醇添加倍数的增大而增大,而混合质量比和水浴时间在设定的范围内都有一个最大值。由于无水乙醇添加量增加,无水乙醇会夺取被大豆肽结合的钙离子重新与氯离子和乙醇形成 CaCl2·4C2H5OH的几率增大,从而减少大豆肽 -钙的得率,所以选择 6倍于混合液体积的无水乙醇添加量是最适合的量;最佳混合质量比和水浴时间可以由上述方程求导得到:混合质量比为4.184∶1,水浴时间为21.287 min。由响应面模型可得出无水乙醇添加 6倍,水浴时间21.28 min、混合质量比4.184∶1是最佳的螯合条件。在该条件下由响应面模型预测的大豆肽 -钙的得率为65.6208%。

为了验证试验的可靠性,采用最优条件进行大豆肽 -钙的螯合。考虑到试验操作的可行性,将最优螯合条件修正为无水乙醇添加 6倍,水浴时间21.3 min、混合质量比4.2∶1。在此条件下测得的大豆肽 -钙得率为 65.4752%,(钙质量比 7.74 g/100 g大豆肽 -钙)与理论预测值的误差为 2.23%,说明采用 RS M法优化得到的浸提螯合条件可靠。

2.3 大豆肽与大豆肽 -钙红外色谱结果

取少量试样,加入 KBr做稀释剂,在玛瑙研钵里研磨至粒子细小而均匀,压片成型。用傅立叶变换红外光谱仪测试,分辨率设置为 4 cm-1,扫描次数 40次。图 9为大豆肽红外色谱图,图 10为大豆肽 -钙红外色谱图。

图 9和图 10分别是大豆肽与钙结合前后的红外光谱图,图 9中 3 274 cm-1是由 N-H伸缩振动引起,而在图 10中,此波段变为 3 376 cm-1,向高波段移动了 102个波数,成为铵盐 NH4+的特征频率,因此可判断,大豆肽中氨基参与了钙的螯合;同时图 9中 1 455 cm-1出的吸收峰在图 10中几乎被掩盖,图9中的 1 400 cm-1在图 10中是 1 408 cm-1,向高波位移动了 8个波数,成为 COO-伸缩振动引起的羧酸盐的特征频率[11],因此,可以判断,羧基参与了大豆肽-钙的螯合反应。

3 结论

3.1 大豆肽 -钙螯合工艺通过响应面法优化后,最佳的工艺参数为:大豆肽与氯化钙的混合质量比4.2∶1,水浴时间 21.3 min,无水乙醇添加 6倍,在此条件下大豆肽 -钙的得率可达 65.4752%,钙质量比为 7.74 g/(100 g大豆肽 -钙产品)。

3.2 通过红外色谱图可以判断,在大豆肽 -钙的螯合试验中,氨基与羧基均参与了螯合反应,关于钙是否与大豆肽通过吸附作用结合的论断在红外图谱中没有体现,有待进一步考证。

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Opti mization of Chelation of Soybean Peptides with Calcium Using Response SurfaceMethod

Sun Lijie1Liang Jinzhong1,2
(College of Forest,Northeast ForestryUniversity1,Harbin 150040)
(College of Food Engineering,Harbin University of Commerce2,Harbin 150076)

To opti mum the chelation technology of soybean peptideswith calcium,based on single factor tests,the response surface method was used to investigate the interaction of soybean peptides to CaCl2ratio,water bath time and the times of absolute alcohol volume to mixed liquor volume;finally their optimum levelswere established.Re2 sults:The times of absolute alcohol volume to mixed liquor is much more i mportant than the other two factors.The optimum process parameters for the soybean peptides-calcium chelation are soybean peptides to CaCl2ratio 4.2∶1,water bath time 21.3 min,and the times of absolute alcohol volume to mixed liquor volume 6.Under the conditions the yield of soybean peptides-calcium is 65.4752%,and the calcium content of product is up to 7.74 g per 100 g soybean peptides-calcium.The comparison of Fourier transform infrared spectroscopy between soybean peptides and soybean peptides-calcium shows that both amino groups and carboxyl groups participate in the chelating reaction.

soybean peptides,sequestration calcium,technology,response surface method

TS201.2

A

1003-0174(2010)01-0022-06

2009-01-20

孙莉洁,女,1983年出生,硕士,食品科学

梁金钟,男,1957年出生,教授,发酵工程