不同剂量纳洛酮后处理对大鼠脑梗死面积的影响

康 荣，刘 毅，张勤功，邓丽云，程周军，蔡 越，朱 毅 (山西医科大学附属肿瘤医院麻醉科，太原 030013)

虽然缺血后处理的神经保护作用已逐渐被研究所证实，但是在实际操作过程中，在非介入条件下对缺血区实施间断的再灌注控制存在一定的难度［1］。现有研究结果表明，在再灌注开始的同时应用药物有可能在缺血区诱发与缺血后处理类似的后处理现象［2，3］。当前，药物后处理研究多集中于心肌缺血领域，涉及神经保护的药物后处理研究很少，纳洛酮的后处理研究文献报道不多。纳洛酮是μ阿片受体阻断剂，其是否具有神经保护作用尚存在争议［4，5］，可能与其剂量依赖效应有关。本研究旨在探讨不同剂量纳洛酮后处理对大鼠局灶性脑缺血－再灌注损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及局灶性脑缺血再灌注模型的制备 成年雄性SD大鼠(北京大学医学部实验动物科学部提供，批号:SCXK京2006－0008)40只，体重270－330 g，腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg体重麻醉，经口气管插管实施机械通气。采用BL－420生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)连续监测心率(HR)和平均动脉压(MAP)。采用 Longa法［6］建立局灶性脑缺血再灌注模型，具体操作方法如下:常规备皮消毒后，取颈正中切口，暴露和游离右侧颈总动脉，通过大鼠右侧颈总动脉置入尼龙线栓(北京沙东生物技术有限公司)，经动脉分叉推送线栓进入颈内动脉，遇到明显阻力表明线栓头端已阻断大脑中动脉，阻断90 min，再灌注24 h。本研究排除操作过程中出现迷走神经损伤、缺血再灌注期间MAP不能维持在60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上、尼龙线栓置入失败或蛛网膜下隙出血、术后24 h内出现感染的大鼠。

1.2 实验分组及处理 40只大鼠随机分为4组(每组n=10):生理盐水对照组(P组)，纳洛酮1 mg/kg体重后处理组(N1组)，纳洛酮5 mg/kg体重后处理组(N2组)，纳洛酮10 mg/kg体重后处理组(N3组)。P组腹腔注射10 ml生理盐水;N1，N2，N3组于再灌注初始分别腹腔注射纳洛酮1，5，10 mg/kg(用生理盐水稀释至10 ml)。

1.3 测定指标 于缺血前(基础状态)，缺血30，60，90 min，再灌注即刻、30和60 min时记录HR和MAP;于再灌注2 h和24 h时行神经功能障碍评分(NDS)［6］:无神经功能缺损症状为0分;轻度局灶性神经功能缺损，即提尾悬空时不能伸展左前肢为1分;中度局灶性神经功能缺损，即行走时向左侧转圈为2分;重度局灶性神经功能缺损，即行走时向左侧倾倒为3分;不能自发行走伴意识障碍为4分。

再灌注24 h时，腹腔注射戊巴比妥钠90 mg/kg，断头取脑，用于测定脑梗死程度。大鼠脑组织－20℃冷冻30 min，沿冠状位切割成厚度为2 mm的薄片，经1%TTC染色20 min，10%甲醛溶液固定24 h。在体视镜下对每个脑片进行数码照相，采用Image-Pro Plus 5.02图像分析软件(Media Cybernetics公司，美国)计算脑梗死面积，脑梗死程度=脑梗死面积÷同侧大脑半球面积×100%。

1.4 统计学分析 采用SPSS 11.5统计软件进行分析，其中正态分布的计量资料采用±s表示，等级资料采用中位数(四分位数间距)表示，符合方差齐性的计量资料，组内和组间比较分别采用重复测量设计的单因素方差分析;方差不齐的计量资料采用F'检验法进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与基础值相比，各组缺血再灌注期间HR和MAP降低(P＜0.05);4组各时点HR和MAP比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

与P组相比，N1，N2组NDS评分差异无统计学意义(P＞0.05)，N3组降低(P＜0.05);与 N1，N2组相比，N3组NDS评分降低(P＜0.05)，4组两时间点NDS评分均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

再灌注24 h后4组的脑梗死面积(IS)与同侧大脑半球面积的比值均增高(P＜0.05)，P组(43±6)%，N1组(42±7)%，N2组(41±6)%和 N3组(28 ±6)% 。与P组相比，N1，N2组再灌注24h后的IS与同侧大脑半球面积的比值差异无统计学意义(P＞0.05)，N3组的IS与同侧大脑半球面积的比值减小(P＜0.05);与 N1，N2组比较，N3组再灌注24 h后的IS与同侧大脑半球面积的比值减小(P＜0.05)，见图1。

表14组各时间点HR和MAP的比较(n=10，±s)Tab 1Comparison of HR and MAP at different time points among 4 groups(n=10，±s)

表14组各时间点HR和MAP的比较(n=10，±s)Tab 1Comparison of HR and MAP at different time points among 4 groups(n=10，±s)

与基础值相比，*P ＜0.05

缺血30 min 60 min HR(次/min) P 组 374.83 ±25.84 368.50 ±22.99 364.50 ±24.92 358.67 ±23.11* 354.67 ±23.40* 352.33 ±20.72* 350.33 ±24.72指标 组别 基础值30 min 60 min 90 min再灌注即刻*N1组 370.17 ±14.61 361.67 ±15.04* 356.33 ±12.22*349.50 ±12.91* 344.33 ±12.69* 338.50 ±12.42* 336.00 ±13.49*N2组 375.33 ±16.37 369.00 ±14.83 364.83 ±13.81 360.17 ±13.24* 356.00 ±13.78* 353.33 ±16.01* 350.67 ±14.83*N3组 363.83 ±13.50 360.50 ±14.86 353.67 ±17.33 349.67 ±18.98* 346.00 ±15.68* 341.67 ±15.88* 341.50 ±14.42*MAP(mmHg) P 组 102.67 ±10.61 100.17 ±10.93 98.33 ±10.99* 95.00 ±12.96* 94.17 ±11.96* 93.67 ±12.71* 93.17 ±12.51*N1组 103.83 ±13.92 101.17 ±12.29 99.50 ±13.53 96.33 ±12.58* 94.67 ±12.82* 92.50 ±14.15* 90.17 ±13.57*N2组 99.33 ±14.92 96.83 ±13.98 94.33 ±12.82* 93.50 ±13.13* 90.33 ±11.91* 89.67 ±12.58* 88.33 ±11.45*N3组 103.17 ±13.11 100.50 ±13.66 98.17 ±14.08* 95.17 ±12.72* 93.83 ±13.32* 91.17 ±12.38* 90.33 ±12.86*

表2 四组NDS评分的比较 ［n=10，M(Qu-Ql)］Tab 2 Comparison of neurological deficit scores among 4 groups ［n=10，M(Qu-Ql)］

图1 再灌注24 h后体视镜下各组脑组织梗死程度Fig 1 The changes of cerebral infract in 4 groups at 24 h after reperfusion under a stereoscope

3 讨论

本研究采用经典的Longa法［6］建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，即通过颅外置入线栓造成大脑中动脉缺血，是目前研究局灶性脑缺血再灌注损伤的最常用模型。该模型的主要优点是操作成功率高、可重复性好、并发症少、一致性脑梗死效果确实，并且能够更好地反映脑卒中的临床特点和病理过程。本研究中P组NDS评分和缺血侧脑梗死面积的比较以及缺血对侧和缺血侧脑组织梗死面积的比较均证实该方法可形成一致的局灶性脑缺血再灌注损伤。

Flamm等［7］对急性脊髓损伤患者的研究表明，静脉注射小剂量纳洛酮(0.14－1.43 mg/kg)后体感诱发电位无任何改善，而静脉应用大剂量纳洛酮(＞5 mg/kg)则可使体感诱发电位显著增强。Capdeville等［8］研究表明，静脉注射纳洛酮1 mg/kg未减轻对缺血造成的大鼠脑神经损伤，而静脉注射纳洛酮5 mg/kg则可有效逆转神经缺损并改善神经功能。Feigenbaum等［9］研究表明，纳洛酮剂量依赖效应的实质是其对多巴胺等神经递质释放和神经细胞内外Ca2+流动的影响与剂量相关:在小剂量下(1 mg/kg)，纳洛酮可促进Ca2+内流，并强化Ca2+内流介导的包括多巴胺在内的多种神经递质的释放;而在大剂量下(10 mg/kg)，纳洛酮则抑制Ca2+内流和神经递质的释放。基于以上原因本研究分别设定了纳洛酮1 mg/kg，5 mg/kg和10 mg/kg三个剂量组，旨在评价不同剂量纳洛酮后处理的神经保护作用。

本研究结果显示，N3组NDS评分和脑梗死程度降低，表明大剂量纳洛酮后处理具有神经保护效应，提示纳洛酮后处理的神经保护效应与其剂量有关。

本研究表明大剂量纳洛酮后处理有神经保护效应，但将这一结果归结为纳洛酮的受体拮抗作用仍缺乏客观证据支持，因为本研究应用的1 mg/kg纳洛酮用量(小剂量)足以完全阻断大鼠体内的各型阿片受体［10］。本研究推测为在三种剂量均完全阻断各型阿片受体的基础上，导致三组实验结果差异的原因为纳洛酮后处理的神经保护效应可能并不是主要来自其阿片受体拮抗作用，而主要是源自阿片受体外作用。研究已经证实纳洛酮可通过以下途径产生神经保护效应:①增强细胞膜稳定性，抑制钙超载和神经递质释放(剂量依赖效应)［9］;②降低体内自由基水平［11］;③抑制小胶质细胞的活化与缺血区的炎性反应［12］。Feigenbaum 等［9］的研究也表明，由于纳洛酮神经保护作用的剂量依赖性是双向的，而其受体拮抗作用是单向的，所以纳洛酮的神经保护作用可能与其受体拮抗作用无关［9］。

综上所述，大剂量纳洛酮后处理可减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，即纳洛酮后处理的神经保护作用与其剂量密切相关。

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