马铃薯茎尖脱毒培养基的筛选及影响因素分析

蒋瑜，张丽芳，朱维贤，李珂

（昆明市农业科学研究院，云南昆明，650213）

马铃薯是世界四大作物之一，由于马铃薯具有适应性强、产量高、营养成分全和产业链长等特点，受到全世界的重视。但马铃薯在种植过程中容易通过昆虫媒介、摩擦接触感染病毒，马铃薯主要又是以块茎进行无性繁殖，这样病毒为害逐年加重，使马铃薯种薯退化，产量下降。马铃薯茎尖分生组织培养是解决马铃薯退化的最有效的方法，它是根据病毒在植株体内分布不均匀性即越靠近新生组织部位（如茎尖和根尖顶端生长点、新生芽的生长锥等处）病毒含量越少的原理，结合使用钝化病毒的热处理方法，通过剥取茎尖分生组织进行培养获得脱毒植株。本文研究了添加不同激素的培养基和茎尖大小对马铃薯茎尖成活及脱毒效果的影响，以期得到合适的培养基，培养出脱毒效果较好的核心苗。

1 材料与方法

1.1 试验材料

由国际马铃薯中心提供的编号为B13-6未脱毒的种薯在昆明市农业科学研究院繁殖的无菌马铃薯组培苗茎尖为试材。

无菌马铃薯组培苗启动培养基配方：MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+肌醇100 mg/L。茎尖培养基配方：①MS+GA30.2 mg/L+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L；②MS+GA30.2 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L；③MS+GA30.2 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L；④ MS+GA30.1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+KT 0.5 mg/L；⑤MS+GA30.1 mg/L+KT 0.04 mg/L；⑥MS+GA30.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+泛酸钙 0.2 mg/L+肌醇100 mg/L。以上培养基均添加食用白糖30 g/L，琼脂 6 g/L，pH 值为 5.8。

1.2 培养条件

温度：25～30℃，光照：2 000～3 000 lx，光照时间：10～12 h/d。

1.3 无菌马铃薯组培苗的获得

将B13-6的薯块洗净进行打破休眠和催芽处理，当薯块顶芽生长至1～2 cm后，放入37℃的恒温箱中进行30 d的热处理，拿出将芽采下用自来水冲洗干净，再在超净工作台上用无菌水漂洗2～3次后，用0.1%的升汞消毒12～15 min，最后用无菌水漂洗4～5次，用消毒好的解剖刀切去芽的底部放入培养基中培养。培养10 d左右后可长出苗，用长出的苗进行扩繁培养，得到无菌马铃薯组培苗，培养基为MS培养基。

1.4 培养方法

在接种室内的超净工作台上，把已繁殖好的无菌马铃薯组培苗茎尖放在解剖镜下，用已经消毒好的解剖针一层一层地剥离叶片，直到最后暴露出圆滑生长点时，用另一根消毒好的解剖针小心切取0.2～0.5 mm大小带1～2个叶原基的茎尖，然后将其分别接种于1，2，3，4，5，6 号培养基上，放入培养室进行培养。

2 结果与分析

将马铃薯茎尖接种于6种不同培养基上，且所切茎尖大小不同，从表1可看出，几种培养基中6号培养基可直接成苗不形成愈伤组织，是较适宜的培养基；其次是5号培养基，但要先形成愈伤组织，后长成苗，且苗少；4号培养基也要先形成愈伤组织，后长成苗，且苗较少；其余的培养基不能成苗，不适宜茎尖脱毒培养。

表1 不同培养基对茎尖生长的影响

表2 剥离大小对茎尖生长的影响及脱毒效果

从表2可看出，带1个叶原基茎尖的脱毒效果较好，但培养天数长，成苗困难；而带2个叶原基的脱毒效果不好，但培养天数短，成苗容易一些。

3 小结与讨论

3.1 材料的选取

试验表明同一个品种个体之间在病毒感染程度上有很大的差异，所以进行茎尖分生组织培养之前，所选的材料必须是表现典型的本品种特性的植株，且植株生长健壮，无明显的病毒性、真菌性、细菌性病害症状，单株产量和大薯率高，收获后要选择符合品种特性的薯块作为外植体繁殖无菌马铃薯组培苗，以提高脱毒效果。由于马铃薯纺锤块茎类病毒病（PSTV）在目前用植物茎尖分生组织方法很难脱掉，在进行茎尖剥离脱毒前，应先对入选的块茎进行PSTV检测，淘汰带有PSTV的薯块。

本试验是利用无菌马铃薯组培苗进行茎尖脱毒，而不是用薯块所发芽尖消毒后直接剥离。通过试验可看出用无菌马铃薯组培苗进行茎尖脱毒更易操作，且污染小，可用的茎尖量大，容易得到脱毒苗。

3.2 培养基的配比

通过本试验可看出，培养基中所加激素的种类及多少对培养效果有很大的影响。在本试验中最适合的培养基是6号，其次是5号培养基，而用6号培养基进行脱毒培养时可直接成苗，用5号培养基进行脱毒培养时要先产生愈伤组织，然后才长成苗，而脱毒苗如果通过愈伤组织这一过程容易产生变异，所以最适合的培养基是6号，但6号培养基培养效果也不是太理想，还需要进一步试验，以便找到更适合的培养基。

通过本试验还可看出，培养基中使用食用白糖也可培养出苗，可代替蔗糖，以减少培养成本。

3.3 对薯块的处理

薯块是在地下，所以表面较脏，如果直接用其萌发的芽繁殖苗容易污染，而将薯块洗净后发芽繁殖无菌苗可降低污染率，得到更多的无菌苗。脱毒材料在进行茎尖组织剥取前，应进行材料的热处理，以钝化病毒的活性，消除马铃薯卷叶病毒，提高脱毒效果。把入选的马铃薯块茎进行打破休眠和催芽处理，当薯块顶芽生长至1～2 cm后，转入恒温箱内进行37℃的高温处理6～8周。通过对薯块进行热处理可提高脱毒效果。

3.4 切取茎尖应注意的事项及茎尖的大小

切取茎尖时应注意以下几点：①剥离叶片时用一根解剖针，当暴露出圆滑生长点时再使用另一根解剖针切，这样可以减少叶片上所带的病毒感染生长点的几率；②切取生长点时应少带一些茎秆组织部分，因为茎杆组织中带有大量的病毒，这样会降低脱毒率；③切取生长点时不要损伤到生长点，如果生长点受损就不可能长成苗。

茎尖的大小直接影响成苗的时间、成苗率及脱毒效果。茎尖越小其培养时间越长，成苗率也越低；茎尖越大，其培养时间相对较短，成苗率也相对较高；而最后的脱毒效果是茎尖越小脱毒的成功率越高。要综合考虑这2个因素。

3.5 病毒检测

由茎尖分生组织培养获得的小苗，经第1次扩繁后要对其进行严格的病毒检测，以确定材料的脱毒情况。一般采用指示植物鉴定法、电镜检测法或抗血清鉴定法，经病毒检测后，确认是不带病毒的株系，才能进一步利用，对带病毒的株系应淘汰或进行再次脱毒。

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