豆芽烂芽的病原菌分离鉴定及致病性研究

2010-11-12张丽吴小刚张力群康玉凡梁海荣

长江蔬菜 2010年2期

张丽，吴小刚，张力群，康玉凡，梁海荣

（1.中国农业大学农学与生物技术学院，北京，100193；2.宁波五龙潭蔬菜食品有限公司）

伴随着社会、经济，特别是科学技术的发展，我国传统家庭作坊式的豆芽生产已被日产60～150 t的程序化、机械化、自动化、可调控的现代生产方式，即豆芽工厂化生产所取代。豆芽工厂化生产采用流水线式作业，即从精选原料豆-清洗、烫豆-浸泡-车间装罐预生-孵化培育（进入生长期）-淋水-出罐-漂洗去豆皮-成品包装-保鲜库存放，到冷链进入市场销售；其规模大、环节多、链条长，尤其是孵化培育过程中温度高、湿度大、避光和相对封闭的环境条件[1]，管理工作的百密一疏，都可导致因种子带菌或环境污染引起有害微生物滋生发展，导致豆芽星点状、团状或窝状烂芽，废弃烂芽损失量约为生产量的10%，而影响豆芽产品的品质与加工效率，以日产70 t计算，每年经济损失达350万元左右。因此，开展工厂化生产豆芽烂芽的病原菌分离鉴定及其致病性研究具有重要的经济社会意义和生产实践意义。

豆科植物是腐霉菌的主要寄主之一，有报道显示腐霉菌能引起俄亥俄州地区大豆的根腐病和猝倒病[2]；国外学者Charles研究表明芸豆和利马豆上的根腐病是Fusarium，Rhizoctonia，Pythium三种病原菌共同作用引起的[3]。黄瓜苗期的猝倒病是由瓜果腐霉引起的[4～5]；猝倒病为茄类蔬菜苗期常见病，常造成植株茎基部水浸状，发软变黄，由瓜果腐霉引起的蔬菜病害的相关报道很多。然而，针对豆芽瓜果腐霉的致病性及其防治方法的研究尚未见报道。因此，本试验对腐霉菌引起的豆芽腐烂病症状进行观察及病症进行研究，分离、鉴定导致烂芽的致病菌属，以期建立相应生态、经济、有效的预防体系，为工厂化豆芽的安全生产提供理论与技术支持。

1 材料与方法

1.1 豆芽病组织的采集与病原物的分离

图1 瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）

2007年11月至2008年1月于规模化豆芽厂采集腐烂绿豆芽病害标样，采用常规的组织分离法[6]进行病原物的分离培养。从样品的腐烂部位切下病健交界处组织，首先置入70%酒精溶液中消毒处理30 s，再用无菌水清洗3遍，置于PDA培养基上培养，28℃连续培养7 d后镜检观察菌丝、孢子囊和卵孢子的形态。

1.2 瓜果腐霉ITS区的克隆测序

将分离纯化后的菌丝接种于PDA液体培养基中，28℃震荡培养5～7 d，离心收集菌丝体。腐霉总DNA的提取采用改良二次沉淀法[7]。采用真菌通用引物 ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCT-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），以腐霉总DNA为模板扩增ITS区。PCR扩增反应条件为：94℃变性 5 min；94℃变性 1 min，52℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，循环数为 35；72℃充分延伸 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后分别连接EcoRⅤ酶切的克隆载体pBluescriptⅡ SK＋（Stratagene 公司），转化 E.coli DH5α，并测序。

1.3 病原菌致病性检测

发芽所用精选绿豆由豆芽厂提供，收获于2007年，千粒质量68 g。

瓜果腐霉在28℃避光条件下，V8培养基[8]上培养3～4 d后，向培养皿中加入无菌水，没过菌丝，在显微镜下观察到游动孢子后；以四层纱布过滤收集孢子悬浮液；采用水培法，进行标准发芽试验，在浸种6 h后，分别用浓度为10个/mL（处理1）、102个/mL（处理 2）、103个/mL（处理 3）和 104个/mL（处理4）的孢子悬浮液各2 mL处理待发芽的绿豆5 min，设置一个空白对照处理，每个处理3次重复，从第2天开始，每天定时测定不同处理豆芽（50根）的发病率和生物产量。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离、纯化及形态学观察

采用组织分离法[6]，对豆芽病组织进行病原菌的分离、纯化，可获得纯化的致病菌株。

PDA培养基28℃条件下培养，显微镜（40×）下形态学观察，病原菌菌落呈放射状，气生菌丝棉絮状，菌丝发达，分枝繁茂，孢子囊为膨大状或瓣状，顶生或间生，泡囊球形。藏卵器球形，壁光滑。卵孢子球形，不满器（图1）。

2.2 病原菌的鉴定

采用病原菌ITS区序列系统发育分析方法，将得到的病原菌ITS区序列与GenBank中的序列进行比较，利用分子生物学软件分析二者之间的同源性并构建发育树（图2）。由图2可知，病原菌与腐霉属中的Pythium aphanidermatum的一致性达到99%，这与形态学结果是吻合的，因此可以确定该病原菌为Pythium aphanidermatum。

2.3 瓜果腐霉的致病性检测

用不同浓度梯度的孢子悬浮液处理绿豆芽，处理间的发病特征、发病率及生物产量存在极显著差异（P＜1%）（图3、图4）。由图3可知，用浓度为 104个/mL的菌液处理后豆芽发病最为严重，在第2天出现烂芽，第3天烂芽达58%，第4天发病率为100%；用103个/mL的菌液处理后豆芽发病较104个/mL的菌液处理轻，第4天烂芽达58%，第5天发病率为92%；而浓度为102个/mL菌液处理后，只有一个重复出现烂芽现象，第5天发病率为24%；浓度为10个/mL菌液处理后，豆芽健康，其发病率为0。由图4可知，浓度为10个/mL和102个/mL菌液处理豆芽后，其生物产量与CK之间差异不显著；浓度为103个/mL和104个/mL菌液处理豆芽后，生物产量与CK相比，存在极显著差异，第3天生物产量开始出现降低，第4天豆芽基本停止生长，第5天生物产量分别降低10.3 g/50根，12.3 g/50根。

图2 根据Pythium属不同种类的ITS序列构建的系统发育树

图3 不同浓度孢子悬浮液对绿豆芽发病率的影响

3 讨论

3.1 关于瓜果腐霉菌的生物学特性研究

据报道，目前已知可侵染豆科、葫芦科、茄科、百合科、禾本科等植株并且造成严重为害的腐霉主要有瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、德里腐霉（Pythium deliense）、终极腐霉（Pythium ultimum）、群结腐霉（Pythium myriotylum）等。它们的主要形态特征是营养体为无隔菌丝体，有的可形成菌丝膨大体和附着孢。无性繁殖从不分化的菌丝上产生孢子囊（游动），呈丝状、瓣状、球状，有顶生、间生和切生多种着生方式；孢子囊与菌丝间常有一隔膜隔开，游动孢子在泡囊内形成。而有性生殖则产生藏卵器、卵孢子和雄器[9]。本研究在显微镜下可清晰地观察到瓜果腐霉的形态特征：无性繁殖产生孢子囊（游动），孢囊梗与菌丝分化不明显，呈裂瓣状，成熟后一般不脱落，萌发时形成泡囊；有性生殖产生卵孢子。有性生殖开始时无隔菌丝顶端形成一个含有多个细胞核的配子囊。配子囊分为雄器（小，棍棒形）和藏卵器（大，球形）。这与前人对瓜果腐霉的生物学特性研究结果相一致。

3.2 关于瓜果腐霉对豆芽的致病性及病症研究

图4 不同浓度孢子悬浮液对绿豆芽生物产量的影响

国内外不少学者对瓜果腐霉的致病性以及吸附与侵染做了大量工作，我国对于腐霉的研究开始于俞大绂1934年研究黄瓜猝倒病的致病菌时，首次报道了第一个腐霉种瓜果腐霉。贺水山等[10]对瓜果腐霉游动孢子侵染番茄和秋海棠的过程进行了研究，结果显示游动孢子主要附着在番茄苗根系的根毛区和根冠上，休止孢子萌发的芽管在侵入根毛之前，能形成附着孢或前侵染丝，而游动孢子对秋海棠的附着主要集中在茎部和叶尖、叶缘处，芽管直接侵入茎、叶的表皮细胞及须根。陈婕等[4]在黄瓜苗期接种瓜果腐霉24 h后，病菌在胚轴皮层内形成游动孢子囊，孢子囊呈指形或裂瓣状，48 h后在胚轴组织内形成卵孢子，病胚轴表皮完全崩解。李永忠等[11]对番木瓜茎基腐病初步研究表明，瓜果腐霉以卵孢子或菌丝体随病组织在土壤中越冬，成为初侵染源。在适宜的温湿度条件下，潜伏于病组织和土壤中的病菌开始生长繁殖并形成孢子囊、释放出游动孢子，借风雨、流水或人为传播，引起发病。瓜果腐霉喜高温高湿，最适温度30～35℃，最高可耐温度达45℃[12]，刘耕春等[13]对草坪禾草腐霉病研究表明，当相对湿度高于90%，持续时间在14 h以上时，即可导致腐霉病的大发生。

关于瓜果腐霉对豆芽的侵染和致病性研究表明，在高温高湿、避光、相对封闭的培育环境条件下，病菌滋生发展，其卵孢子萌发后产生游动孢子，附着在芽体上侵染致病；再在发芽罐内借助淋水和淋水溅射而传播，又以游动孢子作为再侵染接种体，侵染豆芽致病[14]，豆芽的瓜果腐霉病是否是由原料绿豆携带的瓜果腐霉卵孢子与菌丝体作为初侵染源，尚有待进一步研究。

目前，关于瓜果腐霉的病症研究主要集中在蔬菜作物。多数腐霉在各种土壤和水生环境中营腐生而成为重要的植物病原菌，引起蔬菜成株期茎基部病害，出现水浸状斑点，然后逐步扩大为不规则斑块，病组织慢慢变褐腐烂。另外，种子和幼苗在出土前也可腐烂失去萌发能力[9]，还能引起蔬菜贮藏期的腐烂。其对蔬菜的为害症状主要有3种情况：①侵染幼苗引起猝倒；②侵染根和茎部引起根部及其根茎基部腐烂；③成株期为害，在新播草坪的苗期也会有腐霉病的发生，导致幼苗猝倒和茎叶腐烂而枯死。湿度大时枯草团周围尚未腐烂病株上布有蛛丝网般的绵毛状菌丝体，手摸有粘滑感[15]。而在绿豆芽孵化培育过程中，百密一疏，有时可致孵化罐底部出现烂芽现象，发病芽体呈水浸状，病体表面肉眼可见瓜果腐霉菌白色丝状物，有淡淡的刺激性酸臭气味。而室内致病性研究发现，发病芽体表面可见白色菌丝，感病组织呈浅褐色，颜色较深，且有较浓的刺激性臭味。这是否因为生产中豆芽的淋水量较大，由于水的淋洗，使得病体组织的颜色较浅、气味变淡，尚有待进一步研究。

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