脱脂乳的乳酸菌发酵和酶解产物对小鼠脾淋巴细胞增殖影响的比较

冯芳菲，郭 鸰，*，李继昌

（1.东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030；2.东北农业大学动物医学学院药理与毒理教研室，黑龙江哈尔滨150030）

脱脂乳的乳酸菌发酵和酶解产物对小鼠脾淋巴细胞增殖影响的比较

冯芳菲1，郭 鸰1，*，李继昌2

（1.东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030；2.东北农业大学动物医学学院药理与毒理教研室，黑龙江哈尔滨150030）

为探讨脱脂乳乳酸菌发酵产物和碱性蛋白酶水解产物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，采用凝胶过滤法将各发酵和水解产物进行分离纯化，测定不同处理方法和不同分子量范围的肽段对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的差别。结果显示，经乳酸菌发酵或酶水解后的脱脂乳蛋白，尤其是分子量范围＜3kDa的小肽具有较强的免疫调节活性。因此，发酵或水解用于开发低致敏乳源蛋白基料是可行的。

发酵，酶解，脾淋巴细胞增殖

食物过敏是一种变态反应，是由于对食物或食物组分的过敏引起的，代表一种重要的健康问题。尤其在发达的工业化国家，据估计在发达国家中大约有1%～2%的成年人发生食物过敏，而在低于3岁的儿童中这一数字达到8%［1］。牛乳过敏（CMA）是婴儿和儿童中最常见的一种食物过敏，其在1岁左右婴儿对牛乳过敏的比例大约为2%～3%［2-4］，因此研究牛乳过敏是非常有必要的。生产低致敏乳源蛋白基料目前为乳品领域的研究热点。研究显示，低致敏乳源蛋白基料的制备主要有两种途径：乳酸菌发酵或经酶水解。其中乳酸菌及其发酵产物调节免疫应答的能力已在动物疾病模型中得到了深入的研究［5］。已有实验表明在人体和动物研究中，通过食物摄入乳酸菌或酸奶，可提高自然杀伤性细胞活性和T细胞功能。此外牛乳蛋白水解产物可以激活宿主免疫系统，促进体内免疫球蛋白的生成，特别是激活巨噬细胞和T淋巴细胞［6-7］。以脱脂乳为原料，采用乳酸菌发酵和蛋白酶水解方法进行处理。本实验采用实验室保存鼠李糖乳酸杆菌MH22 16S（Lactobacillus rhamnosus strain MH22 16S，简称LR）和实验室保存菌株（简称L14）发酵脱脂乳以及采用碱性蛋白酶（alkaline proteinase，简称AP）水解脱脂乳。脱脂乳经酶解和发酵所得不同产物对免疫性的影响是非常值得探讨的问题。因此，在比较脱脂乳乳酸菌发酵产物和蛋白酶水解产物对小鼠免疫细胞功能的基础上，也比较了其不同分子量的分离组分的免疫调节活性，为将酶解和发酵作为进行生产低致敏乳源蛋白基料的方法提供有力依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株 实验室保存已经证明具有低致敏性的鼠李糖乳酸杆菌 MH22 16S（Lactobacillus rhamnosus strain MH22 16S，LR）；对照菌株 实验室保存菌株（编号L14）；碱性蛋白酶（alkaline proteinase，AP）；脱脂乳粉 黑龙江飞鹤乳业有限公司；MTT Amresco；BCA试剂盒 beyotime；RPMI-1640 HyClone；胎牛血清 solarbio；青链霉素、ConA sigma；96孔板Costar；superdex-75预装柱 AKTA；sephadex G-10 pharmacia；雄性健康Balb/c小鼠 6周龄，体质量16～18g，购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中心。

DHP-9272恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；LGJ-1冷冻干燥机 上海医用分析仪器厂；低温冷冻离心机 上海离心机械研究所；AKTA分离纯化仪 Amersham Biosciences公司；倒置显微镜 奥林巴斯光学工业株式公社；酶标仪Model 680 美国伯乐公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的处理 实验样品分为3组：LR菌株组、L14菌株组及AP组。将LR菌株、L14菌株经MRS培养基活化后，接种10%灭菌脱脂乳，适宜温度培养48h；碱性蛋白酶水解脱脂乳1.5h，50min后沸水浴灭活。所得样品分别以3000r/min，15min离心，上清为可溶性小分子量肽段。将小肽通过superdex-75凝胶柱，根据标准样品可分离纯化收集得到不同分子量范围（＞5kDa，3～5kDa及＜3kDa）的肽段，再将收集所得的肽段通过sephadex G-10凝胶柱脱盐处理，再经冻干以备后续实验。

1.2.2 BCA试剂盒测定样品的蛋白浓度 参考说明书。

1.2.3 脾细胞制备及增殖测定 提取BALB/C小鼠脾淋巴细胞，用pH7.0的完全RPMI-1640培养液（包含10%胎牛血清和0.1%青链霉素）调整细胞密度为2×106/mL，加入96孔板90μL/孔，实验孔加入除菌的脱脂乳（skimmed milk，简称SM）、LR、L14、AP和不同浓度的小肽10μL/孔（终浓度50～2000μg/mL），相同样品分为加ConA 10μL/孔（终浓度为5μg/mL）刺激组和不加ConA刺激组（以培养液补足体积差）。阴性对照为脾细胞加培养液，空白孔为完全培养液。各孔均设3个重复孔。培养48h后加入MTT（5mg/mL）20μL/孔。继续培养4h后，加入三联液（10%SDS，5%异丁醇，0.012mol/L HCl，双蒸水溶解）100μL/孔，过夜。酶标仪570nm测定OD值［8］。结果计算按下式：

2 结果与分析

2.1 可溶性小肽分离纯化结果

所得的三种可溶性小肽，通过superdex-75凝胶柱，根据标准样品分子量大小，可收集得到不同分子量范围（ ＞5kDa，3～5kDa，＜3kDa）的小肽。（如图1～图3所示）。

由分离纯化的出峰图谱看出，不同方法处理脱脂乳所得到的小肽，分子量及其含量均不相同（表1）。

图1 LR菌株发酵脱脂乳游离小肽分离纯化图

图2 L14菌株发酵脱脂乳游离小肽分离纯化图

图3 AP水解脱脂乳游离小肽分离纯化图

表1 各产物不同分子量峰面积（MWt）分布比例（%）

2.2 分离纯化产物蛋白浓度的确定

采用发酵或水解脱脂乳生产的乳蛋白，残余抗原活性降低，而且乳蛋白本身被水解，得到的蛋白质水解物是由分子量大小不等的肽段所组成的混合物，此外，产品中还含有少量无机盐、游离氨基酸等成分。采用BCA试剂盒可测定不同处理方法下分子量组分的蛋白浓度。以吸光值（A）为纵坐标，酪蛋白浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线（图4）。

图4 BCA浓度与吸光值关系的标准曲线

其中 A与 C的关系为：A=0.7821C+0.0838（μg/mL），R2=0.9957。

根据标准曲线计算冻干样品中蛋白的浓度，并根据需要的浓度进行配制。

表2 不同分子量范围的LR、L14和AP对静息期小鼠脾T淋巴细胞增殖能力的影响

表3 不同分子量范围的LR、L14和AP对受ConA刺激下小鼠脾T淋巴细胞增殖能力的影响

2.3 SM、LR、L14、AP组对小鼠脾T淋巴细胞增殖活性的影响

SM、LR、L14和AP组分别测定了未受ConA刺激（图5A）和受ConA刺激（图5B）后，对小鼠脾淋巴细胞增殖影响，该增殖水平以SI（刺激指数）表示。结果表明该4组均刺激静息细胞，并且刺激指数与浓度呈正比关系，当浓度达到2000μg/mL时SI最高。当SM、LR、L14和AP组浓度分别达到500、200、500、200μg/mL时，差异显著（p＜0.05）。SM组较LR组、L14组和AP组的刺激指数低，显示发酵或水解脱脂乳释放出的小肽能够更大地刺激脾淋巴细胞增殖。达到最高浓度（2000μg/mL）时，SM组、LR组、L14组和 AP组的 SI分别为 1.74、2.24、1.97、2.04。在相同的浓度下，LR组SI值高于另外三组，当受ConA刺激时，SM组脾细胞明显因浓度增高（1000～2000μg/mL）而受到抑制，然而，静息期SM组在高浓度（1000～2000μg/mL）仍呈刺激作用。当受ConA刺激时，LR组的浓度达到1000μg/mL时，脾细胞SI差异显著，然而静息期的细胞则在LR达到200μg/mL时，即表现为差异显著。Diane Saint-Sauveur（2004）［9］实验结果显示，乳清分离蛋白（WPI）抑制受ConA刺激的脾细胞的增殖作用，与本实验SM组（2000μg/mL）一致。并且WPI的酶解产物（ED）对静息期与受ConA刺激的脾细胞均呈增殖作用，与本实验中LR、L14、AP组实验结果一致。

2.4 不同分子量范围的LR、L14和AP对小鼠脾T淋巴细胞增殖能力的影响

由LR，L14和AP制备的三部分不同分子量的肽段对小鼠脾细胞的作用同样分为静息期组（表2）和受ConA刺激组（表3）。静息期小鼠脾细胞显著受到三部分肽段的刺激，并与浓度呈一定的正比关系（50～2000μg/mL）。在LR、L14和AP的三段总肽段中，最大SI在浓度最大时出现（2000μg/mL），然而分离纯化得到的各个范围的肽段SI不同。除LR组中＞5kDa的最大 SI出现浓度为500μg/mL；L14组3～5kDa和 ＜3kDa的最大 SI出现浓度分别为1000μg/mL和500μg/mL外；其余SI均与浓度呈正比关系。Mercier等和Prioult等［10-11］也发现与目前使用的相似条件制备的WPI和β-lg肽段具有强烈的刺激脾细胞的增殖作用，可能是由于有不同化学性质（e.g.，pI）的肽段数目以及发生在复杂的混合物比如总水解液中的肽/肽之间的作用都降低而造成的。

图5 不同浓度（50～2000μg/mL）的SM、LR、L14和AP对静息期（A）和受ConA刺激的脾细胞（B）的增殖作用

受ConA刺激的脾细胞与静息期脾细胞比较，各组在相同浓度下SI均增强。除LR＞5kDa外，各个肽段在高浓度（≥1000μg/mL）下与对照组细胞差异显著。

3 结论

从分离纯化结果可以看出，不同方法处理脱脂乳所得到的游离小肽的分子量分布不同，则说明不同的方法处理脱脂乳所得到的产物对小鼠脾细胞具有不同程度的免疫调剂活性。

根据实验结果说明，未经处理的脱脂乳蛋白对静息期脾细胞有轻微的刺激作用，但是对受ConA刺激的脾细胞则具有抑制作用，并与浓度呈正比关系。脱脂乳蛋白经LR、L14菌株发酵和胰蛋白酶水解后，得到的游离小肽对静息期脾细胞均具有刺激作用，并且对受ConA刺激的脾细胞同样产生刺激作用。该结果表明，发酵和水解脱脂乳是对脾细胞是否产生刺激作用的关键。

经过发酵或水解脱脂乳，得到不同性质及分子量的肽段均对静息期和受ConA刺激的脾细胞具有刺激作用。在对静息期的脾细胞作用中，除LR组和AP组分子量范围＞5kDa的小肽之外，其他小肽的最大SI均与浓度呈正比关系。在受ConA刺激的脾细胞作用中，除AP组分子量范围3～5kDa的小肽外，其他均与浓度呈正比。但是，同种处理方式所得到的不同分子量范围的小肽具有不同程度的刺激作用，无伦何种处理方法，所得到的分子量范围＜3kDa的小肽均具有较强的免疫活性。

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Comparison of spleen lymphocyte proliferation between the skimmed milk products of lactobacillus fermentation and enzymolysis in mice

FENG Fang-fei1，GUO Ling1，*，LI Ji-chang2
（1.Key Laboratory of Dairy Science，College of Food，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China；2.College of Veterinary Medicine，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China）

To investigate the effect of spleen lymphocyte proliferation（SLP）between the skimmed milk production of lactobacillus fermentation and enzymolysis in mice.Each product had been purified and separated by gel filtration method，and evaluated the effect of different treatment and different range of peptide on the SLP in mice.The results showed that the lactoprotein which fermented by lactobacillus and hydrolyzed by enzyme，especially the molecular weight of peptide＜3kDa had stronger immunomodulatory activity.This study confirmed that the method of fermentation and hydrolization could be used in exploiting the hypoallergenic protein ingredients from milk source.

fermentation；enzymolysis；spleen lymphocyte proliferation

TS201.1

A

1002-0306（2010）11-0068-04

2009-11-16 *通讯联系人

冯芳菲（1984-），女，硕士研究生，研究方向：乳品营养与安全。

东北农业大学生物乳品创新团队项目；黑龙江省博士后基金。