柑桔萜油抑菌活性的研究

李雪玲，郭 丽

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036）

柑桔萜油抑菌活性的研究

李雪玲，郭 丽

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036）

采用滤纸片法测定了柑桔萜油对食品中常见的几种腐败致病菌的抑菌实验，并研究了pH和高温处理对柑桔萜油抑菌活性的影响。结果表明，柑桔萜油具有广谱的抗菌范围，尤其对霉菌抑制作用更为显著。柑桔萜油抑菌活性的pH作用范围为5～9，并且热稳定性强。

柑桔萜油，抑菌活性

柑桔是芸香科柑桔亚科的一种植物，共有六个属［1］。我国民间就有用柑桔皮烧烟驱赶蚊蝇的作法，国内外已证实这主要是由柑桔皮中的柑桔油在起作用［2］，这说明柑桔油具有很好的杀菌作用。而有关这方面的研究未见报道。近年研究表明，柑桔油生物活性的有效成分是其中的萜油（主要是d-柠檬烯），萜油是柑桔精油脱萜生产中大量废弃的副产物［3］。因此，本实验对柑桔萜油的抑菌作用进行了初步的研究，希望能够充分利用这些废弃的萜油开发出一种天然防腐剂，为柑桔的综合利用开辟一条新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜柑桔皮；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、黑曲霉（Aspergillum niger）、青霉（Penicillium sp）、根霉（Rhizopus sp）、毛霉（Mucor）、假丝酵母（Saccharomyces cerevisiae）、澳大利亚酵母（Saccharomyces australia）、葡萄酒酵母（S.ellipoideus）由本院微生物实验室提供；牛肉膏蛋白胨培养基（细菌用） 牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（霉菌用） 马铃薯300.0g、葡萄糖20.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL，pH自然；麦芽汁培养基（酵母用） 葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母膏10.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL，pH自然；95%乙醇，石油醚，丙三醇，NaOH，HCl，Ca2CO3，Na2SO4，金属钠，含锌粉的乙醇液，溴水等。

YXQ-SG41-280型高压蒸汽灭菌锅，PYX-DHS型隔水式电热恒温培养箱，RE52CS型旋转蒸发器，HH-S11-2型电热恒温水浴锅，BS200S型电子分析天平，HS-1300-U型无菌操作台，721分光光度计，pHS-3C型数字式酸度计，冰箱等。

1.2 实验方法

1.2.1 柑桔萜油的制备

1.2.2 供试菌株的制备［4］在无菌室中将供试菌种接入相对应的试管斜面培养基上。细菌置35～37℃培养18～24h，霉菌在28℃，培养48h；酵母菌置30℃，培养24h，培养完之后放置0～4℃冷藏备用。

1.2.3 培养基平板制备［4］将配制好的各种菌种培养基高压蒸汽灭菌后，冷却至50～60℃，在无菌操作条件下将培养基倾注于高压灭菌后的无菌培养皿内，每皿15～20mL，放平至培养基凝固。

1.2.4 菌悬液制备［4］取活化培养好的菌株，用接种环分别挑取少量细菌、霉菌孢子和酵母菌体，各放入9mL无菌生理盐水中，摇匀，制成孢子、菌体悬浮液，使菌悬液中细菌数为1～2×108个/mL、霉菌孢子数为1～8×106个/mL、酵母菌数为1～7×106个/mL。

1.2.5 滤纸片法［5］取直径8mm的灭菌滤纸片放入柑桔萜油原液中浸泡24h。将各种待试菌悬液各取0.5mL与相应固体培养基制成含菌平板，用无菌镊子取含有柑桔萜油的滤纸片贴在固体平板上，每菌做3次重复。细菌置35～37℃培养18～24h，霉菌在28℃，培养48h，酵母菌置30℃，培养24h后观察，选取抑菌圈比较明显的平板测定抑菌圈直径，结果取3次重复实验的平均值。

1.2.6 柑桔萜油最低抑菌浓度（MIC）的测定 采用平板扩散法［6］，分别将柑桔萜油原液用丙三醇倍比稀释，加入培养基中，用平板划线法接种，细菌置35～37℃培养18～24h，霉菌在28℃，培养48h；酵母菌置30℃，培养24h，以无菌水、空白提取液及提取物稀释剂丙三醇作对照，以完全没有菌生长的最低提取物浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

1.2.7 不同外界条件对柑桔萜油抑菌活性的影响

1.2.7.1 pH对柑桔萜油抑菌活性的影响［7］分别用蒸馏水和柑桔萜油配制霉菌培养基，分装试管，以2mol/L的NaOH和HCl分别配成2份pH3～9的系列培养基，用蒸馏水配制的称为S1、S2，用柑桔萜油配制的称为S3、S4。四份培养基均不灭菌，S1、S3放入冰箱冷藏，S2、S4放入28℃恒温箱培养。以S1、S3作为对照（吸光度A=0），在分光光度计上分别测定相应pH下的吸光度A值。

1.2.7.2 高温处理对柑桔萜油抑菌作用的影响［8］用柑桔萜油提取物代替蒸馏水配制成固体培养基，并在121℃条件下进行湿热灭菌，然后接种四种常见霉菌，28℃条件下培养2d以上，观察生长情况，以用蒸馏水配制的相应培养基作对照。

2 结果与分析

2.1 柑桔萜油的抑菌效果

柑桔萜油对供试菌抑菌效果见表1所示。抗菌素抑菌圈实验结果的标准是：抑菌圈直径＞15mm为最敏感、10～15mm为中度敏感，7～9mm为低度敏感，无抑菌者为不敏感［8］。

从表1可以看出，柑桔萜油对各种供试菌都有一定的抑菌作用。但相比较而言，柑桔萜油对霉菌和酵母菌的抑制作用要明显大于对细菌的抑制作用，尤其是对根霉、毛霉和青霉的抑菌圈达到14.5mm，抑制作用最强；对葡萄酒酵母、澳大利亚酵母、黑曲霉抑菌圈也达到14.0mm，抑菌效果明显；而对细菌也有一定的抑制作用，但效果不太明显。

表1 柑桔萜油对供试菌的抑菌圈直径

2.2 柑桔萜油最低抑菌浓度的测定结果

表2 柑桔萜油提取液浓度对供试菌抑菌效力的影响

见表2。表2表明，柑桔萜油对枯草芽孢杆菌的MIC为100mg/mL，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC为50mg/mL，对假丝酵母的MIC为3.125mg/mL，对澳大利亚酵母和葡萄酒酵母的MIC为1.563mg/mL，对根霉、黑曲霉、毛霉和青霉的MIC为0.782mg/mL。

2.3 pH对柑桔萜油抑菌活性的影响

滤纸片法的测定结果表明，柑桔萜油对霉菌的抑菌效果更为明显，所以本实验选用毛霉为对象菌，研究pH对柑桔萜油抑菌活性的影响。表3列出了毛霉培养1周后S2、S4 pH系列培养物的吸光度A值，其空白对照分别为S1、S3。

表3 不同pH培养物的吸光度值

由表3可以看出，用柑桔萜油配制的霉菌培养基S4中杂菌生长浓度（浑浊度）明显低于用蒸馏水配制的霉菌培养基S2，这表明柑桔萜油在pH5～9均有一定抑菌活性，并且柑桔萜油在酸性条件下抑菌活性明显强于中性。

2.4 高温处理对柑桔萜油抑菌作用的影响

本实验选用霉菌为对象菌，研究高温处理对柑桔萜油抑菌作用的影响，实验结果见表4。

表4 霉菌在经121℃处理的蒸馏水、未高温灭菌和高温灭菌柑桔萜油马铃薯葡萄糖琼脂培养基中的生长情况

表4可以看出，蒸馏水培养基中的霉菌生长情况都很好，而在高温灭菌柑桔萜油培养基中毛霉、青霉和根霉全无生长，黑曲霉有少量菌体生长。说明柑桔萜油经过121℃的高温处理，其抑菌效果并未受到太大影响，这表明柑桔萜油具有良好的热稳定性。

3 结论

柑桔萜油对大多数真菌类均有良好的抑菌作用，尤其是对霉菌极为显著，而且所需的MIC较低，pH作用范围广、热稳定性强。相比较而言，柑桔萜油对细菌则无明显的抑制作用。

在食品加工中，热处理工艺非常普遍，本研究结果显示柑桔萜油具有很好的热稳定性，这就给柑桔萜油在食品工业中的应用提供了基本的理论依据，也预示着柑桔萜油在食品工业中将有着较为广泛的发展前景。因此，对柑桔萜油进行分离、纯化，进而开发成一种天然防腐剂，是本实验下一步有待开展的工作，其具有一定的社会效益和经济效益。

［1］程绍南.柑桔对人体的生理调节机能［J］.中国柑桔，1994（1）：18-20.

［2］孙凌峰，刘秀娟，叶文峰，等.柑桔油和芋烯的性质及制取方法［J］.林产化工通讯，2000（6）：19-23.

［3］李于善，贺艳，邓静，等.柑桔精油中d-芋烯的转化研究［J］.香料香精化妆品，2004（5）：10-12.

［4］杨海燕，郭丽，傅力.辣椒碱的抗菌研究［J］.新疆农业大学学报，2004（4）：63-66.

［5］吴周和，刘建成，吴小刚.藿香中天然防腐剂的提取方法及其抑菌作用研究［J］.中国调味品，2004（8）：18-20.

［6］樊黎生.芦荟汁抗菌作用研究［J］.食品与发酵工业，2001（8）：38-40.

［7］李学红，马庆一，彭雪萍.香辛料抑菌活性研究及其在草莓保鲜中的应用［J］.食品研究与开发，2003（1）：96-99.

［8］顾仁勇，张丽，傅伟昌，等.芭蕉汁的抑菌作用［J］.食品与发酵工业，2005（3）：57-59.

Study on the bacteriostasis of d-limonene

LI Xue-ling，GUO Li
（College of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Bacteriostasis experimentation causing by d-limonene acting on some main spoilage organisms in food were determined by means of filter paper，and confirmed its MlC acting on these microorganisms，and the influences of pH and high temperature on d-limonene bacteriostasis were also studied.The results showed that dlimonene was a broad-spectrum antimicrobial，especially to fungus.ln addition，as to d-limonene bacteriostasis，the range of active pH was 5～9 for spoilage organisms in food and d-limonene had strong heat stability.

d-limonene；bacteriostasis

TS255.1

A

1002-0306（2010）12-0080-03

2009-09-16

李雪玲（1972-），女，讲师，主要从事天然产物分离纯化及功能性的研究。

安徽省农产品安全重点实验室开放基金项目（las200503）。