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复合酶降解高温蒸煮玉米秸秆的饲料化研究

2010-11-10余建军舒国伟李世玉王利红王雅凤

食品工业科技 2010年12期
关键词:产糖量葡聚糖底物

陈 合,余建军,舒国伟,李世玉,王利红,王雅凤

(陕西科技大学生命与工程学院,陕西西安710021)

复合酶降解高温蒸煮玉米秸秆的饲料化研究

陈 合,余建军*,舒国伟,李世玉,王利红,王雅凤

(陕西科技大学生命与工程学院,陕西西安710021)

利用复合酶在其最优条件下降解高温蒸煮玉米秸秆,然后接入混合酵母同步发酵产菌体蛋白。确定了复合酶降解的最优条件:4g底物(蒸煮秸秆3.072g)加入30mL pH4.8柠檬酸缓冲液,调pH4.8,121℃灭菌20min,待冷却,无菌操作下加入25mg纤维素酶、10mg木聚糖酶、6mg β-葡聚糖酶、1.3mg果胶酶,在50℃、100r/min条件下酶解16h,产糖量0.9349g/30mL。混合酵母发酵实验结果表明,玉米秸秆粗蛋白含量为27.125%,是原秸秆蛋白含量的4.13倍,效果显著,酶用量低,发酵周期短。

复合酶,高温蒸煮,玉米秸秆,混合酵母,饲料

玉米秸秆细胞壁结构致密,木质素作为外衣保护着纤维素和半纤维素免受酶的降解[1]。因此要用酶法进行有效降解,需对秸秆预处理[2]。本课题组对玉米秸秆进行高温蒸煮预处理研究时,效果非常好,以降解率为目标研究复合酶降解条件时,降解率达70.03%。国内外很多研究人员对秸秆进行了同步发酵研究[3-5],通过微生物发酵解除了降解所得糖对酶的抑制。但酶活最佳温度一般在37~60℃之间,因此同步发酵时间会比较长[6],且微生物长时间为维持自身新陈代谢会浪费大量碳源,或者需加大酶量弥补不足。本文研究目的为弥补同步发酵缺陷,先让复合酶在其最优条件下降解高温蒸煮玉米秸秆一定时间,以便其降解出尽可能多还原糖,作为后续发酵的启动碳源,然后再接入混合酵母进行同步发酵,缩短秸秆蛋白饲料化时间、节省酶用量、提高还原糖利用率。

1 材料与方法

1.1 实验材料

玉米秸秆 陕西省西安市未央区刚采收完玉米棒的新鲜青秸秆,待晾干,用小型高速粉碎机将原秸秆粉碎,过40目筛,经180℃高温蒸煮1.5h,60℃烘干至恒重(0.768g高温蒸煮秸秆相当于1g原秸秆);产朊假丝酵母(利用六碳糖)、嗜单宁管囊酵母(利用戊糖) 均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC),编号分别为1807、1771;纤维素酶10000U(经 QB2583-2003的 FPA测定方法,滤纸酶活3500U,以下纤维素酶活均表示其滤纸酶活)、木聚糖酶10000U、β-葡聚糖酶10000U、果胶酶30000U 均来自肇东国科北方酶制剂有限公司;酵母粉、蛋白胨生化试剂,北京奥博星生物技术有限公司;产朊假丝酵母活化培养基(g/L) 葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10,250mL三角瓶配制100mL,121℃灭菌20min,斜面菌种试管接入一环,培养20h;嗜单宁管囊酵母与上同,葡萄糖换为木糖;其余药品 均为分析纯。

1.2 实验方法

表1 各单因素条件表

基本酶解条件:称取底物质量1.5g(以原秸秆质量计),加入30mL pH4.8柠檬酸缓冲液,调pH至4.8,121℃灭菌20min。然后加入纤维素酶20mg(滤纸酶活70U)、β-葡聚糖酶8mg(80U)、木聚糖酶8mg(80U)、果胶酶 2mg(60U),温度 50℃,转速100r/min,时间23h。固定其它基本条件,做单因素实验,各单因素条件如表1所示。最后做正交实验,得到最优条件,并验证。

经最适条件降解秸秆一定时间后,接入4%产朊假丝酵母、6%嗜单宁管囊酵母及相应无机盐辅料,在30℃发酵51h,3500r/min离心15min,测上清液可溶性蛋白含量,烘干沉淀物并测粗蛋白含量。

1.3 测定方法

还原糖测定采用DNS法;粗蛋白测定采用微量凯氏定氮法;可溶性蛋白测定采用考马斯G250法。

2 结果与分析

2.1 各种酶量对产糖量影响

由图1(为便于将4种酶解效果曲线图整合在一块,特用相应酶活表示)可知,各种酶量达到一定量后,产糖量不再增加,因为糖浓度达到一定值,会对酶产生严重抑制作用。纤维素酶添加量对产糖影响比较大,一方面因为玉米秸秆含纤维素量高,另一方面纤维素难降解,加大酶剂量,作用显著;木聚糖酶对产糖影响其次,虽然半纤维素易降解,但其含量很高,所以加大酶量效果明显。另两种酶对产糖量影响比较小,可能是纤维素酶本身含有大量内外切葡聚糖酶及β-葡聚糖苷酶缘故,使得β-葡聚糖酶添加量影响轻微,而秸秆果胶含量很低,所以其对产糖量影响也比较低。确定各种酶加量为:纤维素酶20mg(70U)、β-葡聚糖酶8mg(80U)、木聚糖酶12mg(120U)、果胶酶2mg(60U)。

图1 各种酶量与降解所得糖关系

2.2 底物添加量对产糖量影响

图2 底物添加量与产糖量关系

由图2可知,随着底物添加量增大,底物对产糖量影响逐渐减小,特别是其添加量在1.5g以上时,影响明显放缓,说明糖浓度对复合酶降解有明显抑制作用。由于本实验研究目标是使混合酵母接入发酵前有尽可能高的产糖量,而混合酵母接入发酵后,随着糖浓度降低,对复合酶抑制作用减小,即可达到边糖化边发酵目的,因此在这里,选择底物添加量为3g。

2.3 时间对产糖量影响

由图3可知,在酶解16h之后,时间对产糖量基本无影响,已处于近似水平曲线。说明糖浓度已达到几乎完全抑制复合酶的酶活,故选择酶解时间为16h。

图3 时间与产糖量关系

2.4 摇床转速对产糖量影响

由图4可知,复合酶降解高温蒸煮秸秆需要一定摇床转速,通过振荡,以便复合酶更好地与相应被降解物接触,达到良好降解效果,故选择摇床转速100r/min即可。

图4 摇床转速与产糖量关系

2.5 温度对产糖量影响

由图5可知,温度对产糖量影响很大,在一定范围内,升高温度可提高复合酶酶活,加快底物降解;然而温度过高会降低酶的稳定性,使其失活,从而影响酶水解的作用效果,故酶解温度选择50℃。

表2 正交实验设计水平及正交结果

图5 温度与产糖量关系

2.6 pH对产糖量影响

由图6可知,pH对产糖量影响也很大。复合酶对pH很敏感,因为pH过高或过低会改变酶解离状态,影响酶与底物结合,故复合酶的pH条件确定为pH4.8。

图6 pH与产糖量关系

2.7 复合酶降解高温蒸煮玉米秸秆条件的优化

影响复合酶降解高温蒸煮玉米秸秆的主要因素是A(纤维素酶)、B(木聚糖酶)、C(β-葡聚糖酶)、D(果胶酶)、E(底物)、F(时间)、G(pH)、H(温度),根据以上单因素实验设计了以产糖量为指标的L27(313)正交实验,其中加入交互作用因素:A×B、A×C,摇床转速定为100r/min。各条件的因素水平及正交结果,如表2所示。

对表2的原完整正交表进行方差分析,结果如表3所示。

由方差分析表3可知,对产糖量影响的因素大小为:H>F>E>A>A×B>A×C>B=D>G >C。其中:A、E、F及H为高度显著,应选取较好水平为A3E3F3H2。其余均无显著性,可忽略交互作用分析,从节省酶量及酵母发酵时pH需要高点的角度,选取为B1C1D1G2。

由于最优条件不在正交实验表中,故补做最优条件三组平行实验,结果稳定,平均产糖量达到0.9349g/30mL,比以上实验号效果都要好,故选择最优条件:A3B1C1D1E3F3G2H2,即复合酶降解高温蒸煮玉米秸秆的最优条件为:25mg纤维素酶、10mg木聚糖酶、6mg β-葡聚糖酶、1.3mg果胶酶、4g底物(蒸煮秸秆3.072g),16h、pH4.8、温度50℃。

表3 方差分析表

复合酶在最优条件下降解高温蒸煮玉米秸秆16h后,进行同步发酵,摇床转速仍为100r/min。结果,测得上清液的可溶性蛋白几乎为零,沉淀物粗蛋白含量为27.125%,是原秸秆蛋白含量6.56%的4.13倍,且此时测得上清液中还原糖含量1%左右,说明还未发酵彻底,玉米秸秆饲料蛋白含量还有进一步提高的潜力,本课题组对此研究还在进行中。

3 结论

高温蒸煮玉米秸秆的最优复合酶降解条件为:4g底物(蒸煮秸秆3.072g)加入30mL pH4.8柠檬酸缓冲液,调pH4.8,121℃灭菌20min,待冷却,无菌操作下加入25mg纤维素酶、10mg木聚糖酶、6mg β-葡聚糖酶、1.3mg果胶酶,在50℃、100r/min条件下酶解16h,产糖量0.9349g/30mL。经初步混合酵母发酵实验,玉米秸秆粗蛋白含量为27.125%,是原秸秆蛋白含量的4.13倍。实验效果显著,酶用量低,发酵周期短。

[1]Wyman CE,Yang B.Cellulosic biomass could help meet California′s transportation fuel needs[J].California Agriculture,2009,63(4):185-190.

[2]Su Donghai,Sun Junshe,Liu Ping,et al.Effects of Different Pretreatment Modes on the Enzymatic Digestibility of Corn Leaf and Corn Stalk[J].Chinese J Chem Eng,2006,14(6):796-801.

[3]Takagi M,Abe S,Suzuki S,et al.A method for production of alcohol directly from cellulose using cellulase and yeast[J]. Bicoconversion Symposium,1977:551-571.

[4]Wyman CE,Spindler DD,Grohmann K,et al.Simultaneous saccharification and fermentation with the yeast Brettanomyces clausenii[J].Biotechnol Bioeng Symp,1986,17:38.

[5]罗灵芝,李春玲,袁敬伟,等.响应面法优化玉米秸秆同步酶解发酵产乙醇条件[J].生物加工过程,2009,7(3):27-33.

[6]Kadam KL,Rydholm EC,McMillan JD.Development and validation of a kinetic model for enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass[J].Biotechnology Progress,2004,20(3):698-705.

Study on feed of steam-pretreated corn stover degraded by complex enzyme

CHEN He,YU Jian-jun*,SHU Guo-wei,LI Shi-yu,WANG Li-hong,WANG Ya-feng
(College of Life Science&Engineering,Shaanxi University of Science&Technology,Xi’an 710021,China)

Mixed yeast was inoculated for simultaneous saccharification and fermentation and for yielding of mycoprotein,later steam-pretreated corn stover was degraded by complex enzyme under the optimum conditions.The optimal conditions were:4g substrate(steam-pretreated corn stover 3.072g)was put in 30mL citrate buffer solution(pH4.8)and adjusted pH4.8 before pasteurization at 121℃for 20min.Then putting 25mg cellulase,10mg xylanase,6mg β-glucanase and 1.3mg pectase in it,under 50℃,the 100r/min condition enzymolysis 16h,the amount of producing the sugar was 0.9349g/30mL.The content of corn stover’s crude protein was 27.125%as a result of mixed yeast fermentation,and 4.13 times of original stover.The result was highly visible,low enzyme dosage and short fermentation period.

complex enzyme;steam pretreatment;corn stover;mixed yeast;feed

TS201.1

A

1002-0306(2010)12-0176-04

2009-11-24 *通讯联系人

陈合(1956-),男,教授,研究方向:食品生物技术与工程。

陕西省科技攻关项目(2007JK01-13-2);咸阳市科技攻关项目资助(K0311-2)。

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