桂皮黄酮的提取工艺及抗氧化性研究

马世宏

（南京野生植物综合利用研究院，江苏南京210042）

桂皮黄酮的提取工艺及抗氧化性研究

马世宏

（南京野生植物综合利用研究院，江苏南京210042）

主要研究桂皮黄酮的提取工艺及其抗氧化活性。在单因素实验的基础上进行正交实验，结果表明：乙醇浸提法提取桂皮总黄酮的最佳工艺条件为25倍60%乙醇，温度60℃条件下提取1.5h，按照此条件提取桂皮黄酮，得率达79.82mg/g。DPPH自由基清除实验表明，桂皮黄酮具有一定的抗氧化性，且随着浓度升高抗氧化性增强，当浓度大于0.4mg/mL时，DPPH自由基清除率超过90%，但IC50结果显示，桂皮黄酮抗氧化性不及VC和BHT。

桂皮，总黄酮，提取工艺，DPPH，抗氧化性

桂皮又称肉桂，为樟科植物天竺桂、阴香、细叶香桂、肉桂或川桂等树皮的通称，为常用中药，又为食品香料或烹饪调料，中餐里用其给炖肉调味，是五香粉的成分之一。香辛料是天然植物抗氧化剂的重要来源，香辛料的抗氧化成分种类繁多，前期的研究主要倾向于挥发性成分［1］，谷利伟［2］综述了几个辛香料抗氧化代表，其呈抗氧化作用的主要是挥发性成分，有迷迭香、牛芷、百里香等。近年来研究表明，辛香料的乙醇提取物也呈现出明显的抗氧化作用［3-6］。关于桂皮的抗氧化性偶有报道，主要是研究其油脂抗氧化作用［7］，至于其抗氧化主要成分及对DPPH自由基的清除活性没有报道。本研究主要以市售桂皮为材料，研究其黄酮的提取工艺及对DPPH自由基清除活性，为桂皮的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

桂皮 市售；芦丁 购于中国生物检验所；二苯代苦味酰基自由基（2，2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl DPPH，95%） 英国Alfa公司；VC、二叔丁基对甲酚（BHT） 上海国药（集团）化学试剂有限公司；其它试剂 均为分析纯；实验提取及分析用水 超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理 取干燥桂皮切片，粉碎至40目左右，备用。

1.2.2 芦丁标准溶液的制备 准确称取经105℃干燥至恒重的芦丁标准品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100mL，配成150μg/mL的芦丁标准溶液。

1.2.3 标准曲线的绘制［8］准确吸取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，相当于芦丁0、75、150、300、450、600μg移入10mL刻度比色管中，加入30%乙醇液至5mL，各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振摇后放置5min，加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀后放置6min，加1.0mol/L氢氧化钠溶液2mL，用30%乙醇定容至刻度，以零管为空白，摇匀后在最大吸收波长处测定吸光度，绘制芦丁含量（μg）与吸光度的标准曲线。

1.2.4 样品测定 根据样品中总黄酮含量高低，取适宜体积待测液，按标准曲线制备操作步骤于最大吸收波长处进行吸光度的测定。

1.2.5 结果计算 根据标准工作曲线，求出相当于试样吸光度的芦丁含量，按下式求出总黄酮含量：

式中：X-样品总黄酮含量（g/100g）；m1-依据标准曲线计算出被测液中黄酮含量（μg）；m-试样的质量；V1-待测液分取的体积；V2-待测液的总体积。

1.2.6 浸提法提取桂皮总黄酮的工艺优化

1.2.6.1 单因素实验 影响桂皮黄酮提取的影响因素有很多，本文选择4个影响黄酮提取的主要因素，分别为：乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度。以其中一个为变量，固定其他因素，考察不同因素对桂皮黄酮得率的影响。

1.2.6.2 正交实验设计 在1.2.6.1单因素实验的基础上，以提取温度、料液比、乙醇浓度、提取时间四个因素三个水平进行正交实验，以优化该桂皮总黄酮的最佳提取条件。

1.2.7 桂皮中总黄酮含量测定 将总黄酮提取液抽滤去渣，测量提取液体积（V），取样0.1mL，在510nm处测定吸光度，并从校正曲线上读取相应的浓度C（mg/mL），根据浓度计算桂皮总黄酮得率。黄酮得率计算公式如下：

黄酮得率（mg/g）=提取液中黄酮总量（mg）/桂皮原料量（g）

1.2.8 DPPH自由基清除活性［9］取1mL不同浓度的样品提取液及5×10-4mol/L DPPH溶液2mL，用70%乙醇补齐至6mL，室温下静置20min后，在波长517nm下测定吸光度变化，计算样品的DPPH自由基清除率。相应浓度的VC和BHT作为阳性对照。按照下式计算清除率：

式中：A0-未加样的DPPH的吸光度；A-样品与DPPH反应后的吸光度；B-空白样品的吸光度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

芦丁在浓度为0.0075～0.060mg/mL范围内呈直线关系，以最小二乘法计算，其回归方程为：y= 0.0104x+0.0067，相关系数R=0.9997。

图1 芦丁标准曲线

2.2 桂皮总黄酮提取单因素实验

2.2.1 提取温度对桂皮总黄酮得率的影响 取桂皮粉2.0g，固定料液比1∶20，70%乙醇浓度，不同温度提取1h，结果见图2。

图2 提取温度对桂皮总黄酮得率的影响

桂皮黄酮的提取属于固液萃取，即利用物料中的黄酮能溶解在提取溶剂中，黄酮从固相转移到液相中的传质过程，借助分子扩散和对流扩散完成的。升高提取温度，会加快分子扩散速度，从而影响提取过程。而且随着提取温度的提高，溶剂对黄酮的溶解能力增大，从而改变了桂皮的溶解平衡，提高了提取率。温度超过70℃时，随着温度的提高，黄酮得率增加不明显。

2.2.2 料液比对桂皮总黄酮得率的影响 桂皮粉2.0g，70%乙醇作为提取剂，按照不同料液比，在70℃条件下提取1h，结果如图3所示。

图3 料液比对桂皮总黄酮提取的影响

桂皮总黄酮的提取属于固液提取，浓度差是该过程的推动力。溶剂用量越大，桂皮黄酮在物料和溶剂之间的浓度差愈大，对提高传质速率和降低残渣中的黄酮含量愈有利，但溶剂用量过大，造成溶剂回收困难。本实验将选择料液比1∶15、1∶20、1∶25三个水平做正交实验。

2.2.3 提取时间对桂皮总黄酮得率的影响 桂皮粉2.0g，固定料液比1∶20，70%乙醇作为提取剂，在70℃下提取0.5，1.0，1.5，2，2.5，3.0h，结果如图4所示。

图4 提取时间对桂皮总黄酮得率的影响

图4显示，提取时间在1.0～3.0h内，桂皮黄酮的得率先增加后减少，在1.5h达到最高。随着时间延长，得率反而下降。说明桂皮黄酮提取时间在1.5h左右。

2.2.4 乙醇浓度对桂皮总黄酮得率的影响 取桂皮粉2.0g，固定料液比1∶20，70℃下用不同浓度的乙醇提取1h，结果如图5所示。

图5 乙醇浓度对桂皮总黄酮得率的影响

从图5可以看出，随乙醇浓度的增加，总黄酮得率增加。当乙醇浓度增加到70%时，得率达到最高，再继续增加乙醇浓度，黄酮得率减少。

2.3 桂皮总黄酮提取正交实验

根据单因素实验的结果，确定以乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比为四因素，每个因素设三个水平进行L9（34）正交实验设计，以测定桂皮中的总黄酮含量。结果见表1。

表1 L9（34）正交实验方案及结果

比较表1的三个因素的极差R，B的极差最大，其次是D，再次为A，而C的极差最小。极差越大，说明该因素的水平变动时，测得桂皮黄酮得率变动越大，即该因素对实验结果的影响越大。即料液比为最重要的因素，其次是乙醇浓度，再次为提取温度，而提取时间影响不大。这四个因素对得率的影响次序为B＞D＞A＞C，从而确定最优工艺参数为A2B3C2D2。即桂皮黄酮的最佳提取工艺为 25倍60%乙醇，温度60℃条件下提取1.5h。按照此条件做验证实验，桂皮黄酮得率为79.82mg/g，高于正交实验中任意一组实验。

2.4 DPPH自由基清除能力

按以上提取工艺条件提取桂皮黄酮，浓缩干燥后，配制成不同的浓度，按1.2.8的实验方法研究抗氧性，桂皮黄酮和VC以及BHT的DPPH自由基清除效果见图6。

图6显示，桂皮黄酮、抗坏血酸和BHT对DPPH自由基都具有一定的清除效果，且随着浓度升高而逐渐增加。对于DPPH自由基，在各试样浓度小于0.2mg/mL时，清除率由大到小的顺序分别为抗坏血酸、BHT和桂皮黄酮，当桂皮黄酮浓度大于0.4mg/mL时，清除率可以达到90%以上。

按照清除曲线进行拟合，计算桂皮黄酮、VC和BHT清除DPPH自由基的IC50（清除率达到50%时的样品浓度）：

拟合曲线分别为：桂皮样品：y=1485x2-594.5x +90.3（x值范围0.2～0.4mg/g），R2=1，IC50（样品）= 0.314mg/g；VC：y=1603.7x-1.04（x值范围0～0.04mg/g），R2=0.9988，IC50（VC）=0.032；BHT：y=189x+21.94（x值范围0.08～0.2mg/g），R2=0.9988，IC50（BHT）= 0.148。说明桂皮黄酮具有一定的抗氧化性，但不及VC和BHT。

图6 桂皮黄酮自由基清除效果

3 结论

3.1 桂皮黄酮测定采用铝盐显色法，黄酮测定标准曲线为：y=0.0104x+0.0067，相关系数R=0.9997。

3.2 通过正交实验对桂皮黄酮提取工艺进行优化，结果表明，提取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、乙醇浓度（D）这四个因素对得率的影响次序为B＞D＞A＞C，桂皮黄酮的最佳提取工艺为：25倍60%乙醇，温度60℃条件下提取1.5h。按照此条件做验证实验，桂皮黄酮得率为79.82mg/g，高于正交实验中任意一组实验。

3.3 DPPH自由基清除实验表明：桂皮黄酮具有一定的抗氧化性，且随着浓度升高抗氧化性增强，当浓度大于0.4mg/mL时，DPPH自由基清除率超过90%，但IC50结果显示，桂皮黄酮抗氧化性不及VC和BHT。

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Study on extraction technology and antioxidant property of total flavonoids from cassia

MA Shi-hong
（Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plant，Nanjing 210042，China）

The objective of this study was to optimize extraction technology of total flavonoids from cassia with ethanol extraction method.Based on single-factor test，the orthogonal test was carried out.The results showed that the optimal extraction conditions of total flavonoids were ethanol concentration 60%，extraction temperature 60℃，the ratio of solid to liquid 1∶25，and extraction time 1.5h.Under these conditions，the extraction yield of total flavonoids form cassia was 79.82mg/g.DPPH radical scavenging experiment showed that cassia flavonoids possessed certain antioxidant property.Antioxidant property enhanced with flavonoids concentration increased. DPPH radical scavenging rate was more than 90%when flavonoids concentration was up to 0.4mg/mL.The lC50result showed that the antioxidant property of the cassia flavonoids was lower than VCand BHT.

cassia；total flavonoids；extraction technology；DPPH；antioxidant property

TS201.1

A

1002-0306（2010）12-0224-04

2010-06-08

马世宏（1965-），男，副研究员，博士，主要从事天然香料及化妆品研究。

国家“十一五”科技支撑计划重点课题（2006BAD06B02）。