食品中低聚异麦芽糖高效液柑色谱检测方法研究

傅博强，王 晶，*，唐治玉，王远兴，谢明勇，付芳圆

（1.中国计量科学研究院，生物、能源与环境研究所，北京100013；2.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌321005）

食品中低聚异麦芽糖高效液柑色谱检测方法研究

傅博强1，王 晶1，*，唐治玉1，王远兴2，谢明勇2，付芳圆1

（1.中国计量科学研究院，生物、能源与环境研究所，北京100013；2.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌321005）

针对乳制品、固体饮料、糖果、保健品等食品中添加的功能活性成分低聚异麦芽糖，包括异麦芽糖（IG2）、潘糖（P）、异麦芽三糖（IG3）、异麦芽四糖（IG4）的检测，建立了水和乙腈为流动相，梯度洗脱，氨基色谱柱分离，蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detector，ELSD）检测食品中添加的低聚异麦芽糖含量的高效液相色谱方法。异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖的线性工作范围分别为 0.1～0.45mg/mL、0.1～0.45mg/mL、0.2～0.65mg/mL、0.1～0.35mg/mL，线性相关系数R2分别为1、0.9999、0.9998、0.9999。对不同类型的食品，四种低聚异麦芽糖的回收率在98.0%～105.0%之间，方法准确度高。室内重复性变异系数一般都低于10%；除了含量低的异麦芽四糖，室间再现性变异系数一般都低于10%，说明方法的重复性和再现性良好。该方法简单、易于掌握，测定结果准确，适于复杂食品基质中低聚异麦芽糖含量的测定。

食品，低聚异麦芽糖，高效液相色谱法，含量测定

低聚异麦芽糖（Isomaltooligosacharide，简称IMO）是淀粉糖的一种，是葡萄糖基以α-1，6糖苷键结合而成单糖数为2及以上（Gn）的一类低聚糖，其主要成分为异麦芽糖（Isomaltose）、潘糖（Panose）、异麦芽 三 糖（Isomaltotriose）及 异 麦 芽 四 糖（Isomaltotetraose）等［1］。低聚异麦芽糖广泛存在于大麦、小麦和马铃薯等植物中，在酱类、蜂蜜及果葡糖浆中也有少量存在。商品低聚异麦芽糖产品规格主要有两种：IMO-50型（IG2+P+IG3+Gn≥50%）和IMO-90型（IG2+P+IG3+Gn≥90%）。IMO-50型含有一定量葡萄糖、麦芽糖；而IMO-90型含葡萄糖和麦芽糖较少，产品纯度较高［1］。低聚异麦芽糖属于非消化性低聚糖类，难以被胃酶消化，具有水溶性膳食纤维功能，其热量低，基本上不增加血糖血脂，有助于维持肠道正常细菌群平衡，改善腹泻与便泌，提高机体免疫力［2］。鉴于低聚异麦芽糖的特性和保健功能，其已被日益广泛应用于保健品、食品、医药、化妆品等领域［3］。为了实现对食品中添加的低聚异麦芽糖含量的准确定量，需要建立适用性强的检测方法。不同聚合度IMO结构和性质相似，GB/T 22224 -2008中采用的凝胶柱无法实现有效的分离分析。我国《低聚异麦芽糖》产品标准GB/T 20881-2007中，对低聚异麦芽糖糖浆和糖粉中的各种低聚异麦芽糖的含量采用TSKgel Amide-80氨基键合柱，乙腈∶水（67∶33）作为流动相、流速1.0mL/min、柱温75℃，外标法进行定量［1］。对食品中添加的低聚异麦芽糖测定，李黎等［4］采用氨基色谱柱、乙腈∶水（67∶33）作为流动相、流速1.0mL/min、柱温40℃分离测定冲剂和干吃鲜奶片等食品中的低聚异麦芽糖，平均回收率为97.27%，样品测定值相对标准偏差为1.53%～7.89%（n=5）。陈桂茹等［5］使用300mm×4.6mm的Hypersil氨基柱，乙腈∶水（78∶22）为流动相，内部温度为40℃的示差检测器，测定饮料中低聚异麦芽糖的含量，异麦芽糖和异麦芽三糖的回收率范围分别为88.5%～101.0%、90.1%～102.0%，相对标准偏差 ＜5%。食品基体成分复杂，只能采用等度洗脱的示差折光检测器已不能满足不同基体食品中低聚异麦芽糖含量的测定，本研究以酸性乳饮料、口服液和果冻作为研究对象，建立了水和乙腈为流动相梯度洗脱，氨基色谱柱分离，蒸发光散射检测器分析检测食品中添加的低聚异麦芽糖含量的高效液相色谱法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石油醚（30～60℃） 分析纯；异麦芽糖标准品（纯度≥98%）、潘糖标准品（纯度≥98%） Sigma公司，分析纯；异麦芽三糖标准品（纯度≥98%）、异麦芽四糖标准品（纯度≥95%） 美国US Biological公司，分析纯；乙腈 Fisher公司，色谱纯；酸性乳饮料、口服液、果冻样品 市售，购自北京市某超市。

100、1000μL移液器 美国ephendof公司；50mL Teflon具螺纹盖离心管 美国 nunc公司；孔径0.45μm的有机相微孔滤膜、1.0mL一次性无菌注射器、空气发生器 国产；Agilent 1200高效液相色谱系统 配有四元高压输液泵、自动进样器、柱温箱、ChemStation色谱工作站和35900E数模转换器，美国安捷伦公司；Alltech ELSD 2000ES蒸发光散射检测器 美国 Grace公司；ME235S sartorious电子天平（感量0.0mg）、CP324S Ssartorious电子天平（感量0.1mg） 北京赛多利斯天平有限公司；pc 420D磁力加热搅拌器 北京康林科技有限责任公司；DZF-6050真空干燥箱 上海博讯事业责任有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司；IKA MS2旋涡混合器 德国；CQ25-12D超声波清洗机 上海新芝仪器责任有限公司；3k30台式高速冷冻离心机 德国SIGMA公司；旋转蒸发仪 日本EYELA公司；MiLLi-Q超纯水制备系统 美国MILLIPORE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 低聚异麦芽糖混合标准储备液的配制 准确称取异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖标准品各约5mg（精确至0.01mg）至10mL容量瓶中，加水定容至刻度，混合均匀，称重（精确至0.1mg），得到标准储备液，4℃冰箱中可稳定保存1个月。浓度用质量浓度表示（mg/g）。

1.2.1.2 低聚异麦芽糖混合标准工作溶液的配制

用移液器分别准确移取低聚异麦芽糖混合标准储备液250、500、1000μL，称重（精确至0.1mg），分别补加水750、500、0μL，得到浓度分别为0.125、0.25、0.5mg/mL的系列混合标准工作溶液，4℃冰箱中可稳定保存1个月。

1.2.2 样品的预处理

1.2.2.1 样品的干燥处理 对奶粉、豆粉等固体粉末状样品，如果计算占干物质的含量，需要依据GB/T 5009.3-2003《食品中水分的测定》测定水分含量。

1.2.2.2 样品的脱脂处理 对脂肪含量大于20g/100g的样品如奶粉、豆粉，需进行脱脂处理。方法如下：称取1.5g干燥后的样品，精确至0.1mg。放在50mL离心管中，加40mL石油醚，磁力搅拌器搅拌30min，冰箱中冷却10min。3000r/min（离心力1620×g）离心5min，弃掉上清液，重复以上步骤2次。将离心管盖子打开，在通风橱中蒸发残存的石油醚，然后放入60℃真空干燥箱干燥2h，研磨成粉末。称量脱脂干燥后的样品，精确至0.1mg，计算脂肪含量。

1.2.3 样品的提取

1.2.3.1 固态样品 称取经干燥、脱脂处理的奶粉或豆粉1.2g左右（精确称量至0.1mg），放在50mL离心管中。加 10mL 80℃热水，在 80℃水浴中提取10min，在0、5、10min时用涡旋仪分别涡旋10s。取出后，冷却至室温。加10mL乙腈，剧烈振荡5min，静置30min，8000r/min（离心力6010×g）离心5min，取上清液转移至25mL容量瓶中，加水定容至刻度。取1.5mL用0.45μm的有机相微孔滤膜过滤，所得滤液供HPLC分析。

1.2.3.2 液态乳制品样品 准确吸取12.5mL酸性乳饮料，放在50mL离心管中。与同体积的乙腈混合，充分振摇5min后静置30min，8000r/min（离心力6010×g）离心5min，转移上清液至25mL容量瓶中。在离心的沉淀中再加入3mL 80℃热水和2mL乙腈，充分振摇后静置，8000r/min离心5min，将两次的上清液合并。提取液用0.45μm的有机相微孔滤膜过滤，所得滤液供HPLC分析。

1.2.3.3 口服液 准确吸取一定体积的口服液，用50%的乙腈定容至25mL容量瓶中。从此溶液中取一定体积的溶液，用50%乙腈稀释至合适的浓度（使低聚异麦芽糖的浓度在标准工作曲线的线性范围内，即0.1～0.65mg/mL）。用0.45μm的有机相微孔滤膜过滤，所得滤液供HPLC分析。

1.2.3.4 糖果类（果冻） 称量1.0g果冻，精确称量至0.1mg，置于50mL离心管中。加10mL 80℃热水，在80℃水浴中提取10min，在0、5、10min时用涡旋仪分别涡旋10s。取出后，冷却至室温。加11mL乙腈，剧烈振荡5min，静置30min，6010×g离心5min，取上清液转移至25mL容量瓶中，加水定容至刻度。取1.5mL用0.45μm的有机相微孔滤膜过滤，所得滤液供HPLC分析。

1.2.4 色谱分析条件

1.2.4.1 高效液相色谱分离条件 色谱柱：Alltech PrevailTMCarbohydrate ES氨基色谱柱（4.6mm × 250mm，5μm），保护柱（4.6mm×20mm，5μm，美国Grace公司）；柱温：30℃；流动相：A：乙腈，B：水。

梯度洗脱程序见表1、表2。

表1 只含低聚异麦芽糖食品样品的梯度洗脱程序

表2 同时含低聚异麦芽糖和低聚果糖的食品样品的典型梯度洗脱程序

对不同的食品基体，洗脱条件进行相应的调整。

流速：1.0mL/min；进样量：10μL。

1.2.4.2 蒸发光散射检测器分析条件 对 Alltech ELSD 2000ES蒸发光散射检测器，设定漂移管温度87℃，载气流速2.3mL/min。

1.2.5 测定方法 在1.2.4.1色谱条件下测定系列低聚异麦芽糖混合标准工作溶液中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖的响应值（峰面积），以浓度为横坐标，低聚异麦芽糖的峰面积为纵坐标，分别绘制4种低聚异麦芽糖的标准曲线，用二次方程对曲线进行拟合，得到校准工作曲线二次线性回归方程。

取10μL样品溶液注入高效液相色谱仪，测定试样的响应值（峰面积）。由4种低聚异麦芽糖的校准工作曲线线性回归方程，采用外标法计算样品溶液中低聚异麦芽糖的浓度。

1.2.6 结果计算 样品中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖的含量按下式计算：

式中：X-异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖的含量，单位为mg/100g样品；ci-由校准工作曲线线性回归方程计算得到的异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖的质量浓度，单位为mg/mL；V-样品定容的体积，单位为mL；DF-稀释因子，即待测的样品溶液被稀释的倍数；m-脱脂后样品的称样量，单位为g；F-样品的脂肪含量，单位为%。

平行测定结果用算术平均值表示，保留两位有效数字。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线及线性范围

不同于紫外和示差折光检测器，ELSD检测器的响应值（Y）与被测物浓度（X）的关系曲线比较复杂，在低浓度范围内，响应值与被测物浓度为二次函数关系，即Y=aX2+bX+c，在较高浓度范围内，才大致呈线性［6］。食品中添加的低聚异麦芽糖的量都不高，因此，本研究的校准工作曲线采用二次方程进行拟合，结果表明，异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖的线性工作范围分别为0.1～0.45mg/mL、0.1～0.45mg/mL、0.2～0.65mg/mL、0.1～0.35mg/mL，线性相关系数R2分别为1、0.9999、0.9998、0.9999，浓度与峰面积的线性关系良好，见图1。

图1 异麦芽糖（IG2）、潘糖（P）、异麦芽三糖（IG3）、异麦芽四糖（IG4）的标准工作曲线

2.2 不同类型食品中低聚异麦芽糖高效液相色谱分析谱图

对不同类型的食品，其中各种营养成分的组成和含量各不相同，因此需要对流动相的比例和洗脱程序进行调整，以保证四种低聚异麦芽糖与食品基体中干扰成分，尤其是碳水化合物类的其它低聚糖实现有效的分离。酸性乳饮料、口服液和果冻中低聚异麦芽糖的分析谱图见图2～图4。果冻样品中同时含有低聚异麦芽糖和低聚果糖，它们的性质相近，因此会干扰彼此的分离。通过优化乙腈的起始浓度和洗脱梯度的变化速度，可以将低聚异麦芽糖与低聚果糖（蔗果三糖GF2、蔗果四糖GF3、蔗果五糖GF4）有效分离，见图4。

图2 酸性乳饮料中低聚异麦芽糖高效液相色谱分析谱图

2.3 方法的检出限

Study on determination of isomaltooligosaccharides in foods by high performance liquid chromatography method

FU Bo-qiang1，WANG Jing1，*，TANG Zhi-yu1，WANG Yuan-xing2，XIE Ming-yong2，FU Fang-yuan1
（1.National Institute of Metrology，Beijing 100013，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 321005，China）

For the determination of isomaltooligosaccharides in foods such as dairy products，solid drinking，candy and healthy food，a high performance liquid chromatography method was established.lsomaltose（lG2），panose（P），isomaltotriose（lG3）and isomaltotetraose（lG4）in various foods were separated on a NH2column by gradient elution and detected by evaporative light-scattering detector（ELSD）.The linear ranges of the calibration curves for lG2，P，lG3and lG4were 0.1～0.45mg/mL，0.1～0.45mg/mL，0.2～0.65mg/mL and 0.1～0.35mg/mL，respectively. The linear correlation coefficients（R2）were 1，0.9999，0.9998 and 0.9999，respectively.As to different kinds of foods，the spike recoveries were in the range of 98.0%～105.0%.Coefficient variability of repeatability and reproducibility were less than 10%，respectively，except the reproducibility of isomaltotetraose.The method was simple and was apt to be grasped，can be used in the quantification of isomaltooligosaccharides in complex food matrix.

food；isomaltooligosaccharides；high performance liquid chromatography；content determination

TS247

A

1002-0306（2010）10-0388-05

2010-08-18 *通讯联系人

傅博强（1975-），男，博士，副研究员，研究方向：食品及生物计量。

国家标准化管理委员会国标委（20071141-T-469）。