UPLC测定山茱萸生品与酒炙品中齐墩果酸与熊果酸的含量

喻喜华，陈晓辉，戴荣华，毕开顺

(沈阳药科大学药学院,辽宁 沈阳 110016)

*陈晓辉，Tel：(024)23986259，E-mail：cxh_syphu@yahoo.com.cn

UPLC测定山茱萸生品与酒炙品中齐墩果酸与熊果酸的含量

喻喜华，陈晓辉*，戴荣华，毕开顺

(沈阳药科大学药学院,辽宁 沈阳110016)

目的建立山茱萸药材中齐墩果酸和熊果酸的超高效液相色谱含量测定方法。方法采用超高效液相色谱法，ACQUITY UPLCTMHSS C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相：甲醇-0.1%甲酸水(85∶15)，流速：0.2mL·min-1，检测波长：210nm。结果齐墩果酸和熊果酸分别在0.010～0.500mg·mL-1(r=0.9999)、0.010～0.500mg·mL-1(r=0.9999)与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为100.4%、94.4%(n=9)，RSD均为1.8%。结论该方法快速、简便、准确，可用于山茱萸药材的质量控制。

山茱萸；超高效液相；齐墩果酸；熊果酸

山茱萸Cornusofficinalis为《中国药典》收载的常用中药,其性味酸、涩，微温。具有补益肝肾，涩精固脱功能。用于眩晕耳鸣，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，崩漏带下，大汗虚脱，内热消渴[1]。山茱萸中主要活性成分齐墩果酸有较强的抗炎、抗病毒、降糖和保肝作用[2]，熊果酸有抗菌消炎、降低血糖的作用,是山茱萸抗糖尿病的有效成分之一[3]。文献报道的其含量测定方法有薄层扫描法[4]、HPLC-UV[5]、GC[6],还有报道采用HPLC-ELSD[7]对山茱萸中齐墩果酸和熊果酸进行含量测定。齐墩果酸和熊果酸为三萜酸类同分异构体，性质相似。以上分析方法有灵敏度低、干扰大、分析时间长、操作繁琐等不足。超高效液相色谱法(UPLC法)具有低流速、快速、超高效分离的特点。本研究首次采用UPLC测定山茱萸生品和酒炙品中齐墩果酸与熊果酸的含量,结果表明该方法快速、简便、准确,可用于山茱萸药材的质量控制。

1 仪器与试药

WatersACQUITYUPLCTM：二元泵系统，自动进样器，2996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站；AT200(0.1mg)型电子天平，KQ-250DB型超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。齐墩果酸对照品(纯度大于98%，购于sigma公司,批号093K0961)，熊果酸对照品(纯度大于98%，购于sigma公司,批号042K1240),甲醇、甲酸(色谱纯，购于sigma公司)，水(Milli-Q纯水处理系统，Millipore)。

山茱萸药材分别购自安徽、浙江、陕西、河南、辽宁和北京，经沈阳药科大学中药学院孙启时教授鉴定为山茱萸CornusofficinalisSieb. et Zucc.的干燥成熟果肉。将以上药材粉碎，过筛，取60目以下粉末放入真空干燥箱60℃下干燥24h，取出后放入干燥器内备用。

2 方法与结果

2.1对照品溶液制备

分别称取齐墩果酸和熊果酸对照品约10mg，精密称定，用甲醇溶解，定容至10mL，即得。

2.2供试品溶液制备

称取山茱萸药材粉末1.0g，精密称定，置25mL锥形瓶中，加入10mL甲醇，密塞，称定质量，超声提取30min,再次称定质量，用甲醇补充损失的质量，取上清液，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3色谱条件与系统适用性

ACQUITYUPLCTMHSSC18色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：甲醇-0.1%甲酸水(85∶15)；流速：0.2mL·min-1；进样体积：5μL；检测波长：210nm；柱温：30℃。在上述色谱条件下分析，理论塔板数按齐墩果酸、熊果酸计算均不低于5000，样品中齐墩果酸、熊果酸与相邻峰分离度均大于1.5，对照品及样品色谱图见图1。

2.4线性关系的考察

精密吸取混合对照品溶液0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，2.5mL,分别置5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得标准系列溶液。取齐墩果酸和熊果酸混合对照品系列溶液，在2.3项色谱条件下进样分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算得齐墩果酸回归方程为Y=1.11×104X+2.14×104，r=0.999 9，熊果酸回归方程为Y=9.77×103X+3.39×104，r=0.999 9，结果表明齐墩果酸浓度在0.010～0.500mg·mL-1，熊果酸浓度在0.010～0.500mg·mL-1线性范围内与峰面积具有良好的线性关系。

2.5精密度试验

取山茱萸供试液，在2.3项色谱条件下连续进样6次，计算仪器的精密度，得齐墩果酸和熊果酸的RSD分别为1.24%,0.48%。

2.6重复性试验

取同一山茱萸粉末6份，每份约1.0g，精密称定，按2.2项下的方法操作制备供试品溶液，在2.3项色谱条件下进样分析，测得齐墩果酸和熊果酸的RSD分别为0.98%,0.75%。

2.7稳定性试验

取山茱萸供试液，于室温下放置，在2.3项色谱条件下分别于0,2,4,8,12,24h进样分析，测得齐墩果酸和熊果酸的RSD分别为0.95%,0.87%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.8回收率试验

称取已知含量的山茱萸粉末9份，每份约1.0g，精密称定，每3份为一组，每组分别精密加入一定量的齐墩果酸、熊果酸对照品。按2.2项下操作制备供试液，在2.3项色谱条件下进样分析，加样回收试验结果见表1～2。

表1 齐墩果酸加样回收率试验

表2 熊果酸加样回收率试验

2.9样品测定

分别取不同产地的山茱萸生品和酒炙品粉末约1.0g，精密称定，按“2.2”项下方法操作制备供试液，在“2.3”项色谱条件下进样分析，代表性色谱图见图1，齐墩果酸和熊果酸的含量测定结果见表3。

图1 对照品和样品UPLC图

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注：n=3

3 讨论

本试验采用了超声提取法考察甲醇、乙醇的提取效率，结果表明甲醇的提取效率高；在此基础上考察了超声提取次数、提取时间、溶剂用量对实验结果的影响，结果表明用甲醇超声提取1次，提取30min即可将山茱萸中的齐墩果酸和熊果酸提取完全。

结果显示，不同产地山茱萸药材中齐墩果酸、熊果酸的含量差异不大；而酒炙品较生品中的齐墩果酸和熊果酸的含量略高。炮制是否可提高山茱萸中齐墩果酸和熊果酸的含量，尚需实验考察。

[1] 国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：26.

[2] 田丽婷,马龙,堵年生.齐墩果酸的药理作用研究概况[J].中国中药杂志,2002,27(12)：884-886.

[3] 杨剑芳,路福平,高文远,等.山茱萸的化学、药理及开发应用研究进展[J].现代生物医学进展,2006,6(12)：127-133.

[4] 冀春茹,袁珂,胡润淮,等.冬凌草中熊果酸,齐墩果酸的薄层扫描测定[J].中医药学报,1997,(6)：43-44.

[5] 徐德然,丁晴,王峥涛.HPLC法测定山茱萸及知柏地黄丸中齐墩果酸、熊果酸的含量[J].中草药,2002,33(11)：996-997.

[6] 闫花丽,赵陆华,朱丹妮,等.衍生化气相色谱法测定下枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量[J].中国中药杂志,1999,24(12)：744-746.

[7] 赵永席,马国营,梁恒.RP-HPLC-ELSD测定山茱萸中齐墩果酸与熊果酸的含量[J].中成药，2005，27(11)：1314-1316.

DeterminationofOleanolicAcidandUrsolicAcidinCrudeandProcessedFructusCornibyUPLC

Yu Xihua, Chen Xiaohui, Dai Ronghua, Bi Kaishun

(SchoolofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,ShenyangLiaoning110016,China)

Objective: To develop a method for the determination of the contents of oleanolic acid and ursolic acid in crude and processed Fructus Corni by UPLC.MethodsAn ACQUITY UPLCTMHSS C18column (2.1mm×100mm，1.8μm) was used with methanol-0.1% formic acid water (85∶15) as the mobile phase .The flow rate was0.2mL·min-1and the detection wavelength was210nm.ResultsThe calibration curve showed good linearity relationships in the ranges of0.010～0.500mg·mL-1(r=0.9999) and0.010～0.500mg·mL-1(r=0.9999) for oleanolic acid and ursolic acid, respectively. Average recoveries of oleanolic acid and ursolic acid were100.4% with RSD=1.8% (n=9) and94.4% with RSD=1.8%(n=9), respectively.ConclusionThis method was simple, fast, accurate and reproducible, which was suitable for the quality control of Fructus Corni.

Fructus Corni; UPLC; Oleanolic Acid; Ursolic Acid

2010-03-16)