丙烯酰胺分子印迹聚合物的制备及其性能研究*

权英，孙静，沈阳，詹月华，张根华，丁建英，秦红

(苏州市食品品质与安全重点实验室，常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟，215500)

丙烯酰胺分子印迹聚合物的制备及其性能研究*

权英，孙静，沈阳，詹月华，张根华，丁建英，秦红

(苏州市食品品质与安全重点实验室，常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟，215500)

以丙烯酰胺的结构类似物丙酰胺为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用本体聚合法制备出了对丙烯酰胺具有较好选择性的印迹聚合物。通过振荡吸附实验优化出模板分子和功能单体的最佳摩尔比为1∶8;静态吸附平衡实验和Scatchard分析结果表明，与非印迹聚合物相比，印迹聚合物对丙烯酰胺具有较强的吸附特性，最大吸附量为4.283 mg/g;客体-聚合物的解离常数KD为2.77μg/mL。红外光谱分析表明，聚合物的特异性识别位点的形成是由于酰胺键和羧基所形成的氢键的作用。

丙烯酰胺，分子印迹，吸附

2002年4月瑞典国家食品管理局(national food administration，NFA)和斯德哥尔摩大学研究人员率先报道，一些富含淀粉类的食物(如炸薯条、面包等)经过120℃或更高温油炸或烧烤能生成一种毒性物质—丙烯酰胺。由于丙烯酰胺是一种水溶性的神经毒性物质，对龃齿动物具有致癌性，国际癌症研究机构(IARC)已将其归为对人类很可能具有潜在致癌性的物质。该研究结果已引起包括欧盟、FAO/WHO、美国谷物化学家协会(AACC)、FDA、美国食品工艺师协会(IFT)等国际组织在内的广泛关注［1］。

目前，丙烯酰胺的检测方法主要有液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱-串联质谱法、电喷雾电离(ESI)-碰撞诱导多级反应离子扫描监测串联质谱等［2－7］。这些仪器分析方法虽然具有较高的灵敏度，但是其样品预处理复杂，检测过程繁琐，所需费用较高，而且需要专门的技术人员。在此背景下，新的检测技术或样品预处理方法被积极的开发出来，分子印迹技术就是其中一项。分子印迹是集高分子合成、物化分子设计、分析、分离和测试，生物和医学等众多相关学科的优势，相互渗透而发展起来的一种材料制备的新技术，具有高度的特异性和选择性。

丙烯酰胺中带有双键容易和其他烯类单体发生聚合，因此，将丙烯酰胺作为模板分子合成聚合物时，很难将其从印迹聚合物中洗脱，这在痕量分析中会产生假阳性或使检测结果偏高。本文采用虚拟印迹技术［8］，将与丙烯酰胺的空间结构、大小、官能团类似的丙酰胺作为模板分子来合成分子印迹聚合物，并对模板分子与功能单体的最佳配比，印迹聚合物的等温吸附性、动力吸附性、红外表征等方面进行研究。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与仪器

甲基丙烯酸(MAA)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(98%，上海奥宇生物科技有限公司)，偶氮二异丁腈(AIBN)(化学纯，上海试四赫维化工有限公司)，丙酰胺(色谱纯，美国Sigma-Alorich公司)，丙烯酰胺(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

TU－1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，超声波清洗器(上海生析超声仪器有限公司)，HY－2型调速多用振荡器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，索氏脂肪提取器(太仓市华美生化仪器厂)，电热恒温干燥箱(上海博泰实验设备有限公司)，TG16－WS台式高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，NICOLET380傅立叶红外光谱仪(美国Thermo公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分子印迹聚合物的制备

采用虚拟印迹方法，选择丙烯酰胺的结构类似物丙酰胺为模板分子来制备丙烯酰胺分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)。

称取模板分子丙酰胺和功能单体甲基丙烯酸(MAA)的摩尔比分别为 1∶6、1∶8和1∶10，加入摩尔数为功能单体5倍的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，用 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)配置成预聚溶液，超声混匀，静置12 h，使其发生预聚合。向预聚溶液中加入偶氮二异丁腈(AIBN)，其中AIBN的质量为EGDMA质量的1%，超声波脱气后转入安培瓶中，封管后放入60℃水浴中引发聚合24 h。将所得块状聚合物粉碎，过250目筛。向聚合物颗粒加入100mL甲醇，超声波清洗2 h，振荡过12 h，过滤后用蒸馏水清洗残余的甲醇，在紫外分光光度计中于210 nm检测滤液确认无吸收峰，用丙酮进行索氏抽提24 h，放入 60℃烘箱烘干［9］。

空白聚合物(non-imprinted polymer，NMIP)的制备方法同上，只是不加模板分子。

1.2.2 单体与模板分子比例的优选

采用振荡吸附实验来优化模板-单体的最佳比例［10］。

取20 mg不同模板-单体比例的聚合物(MIP或NMIP)，向其中加入20mL浓度为5μg/mL的丙烯酰胺溶液，超声排气5 min，振荡24 h，使之达到吸附平衡，以5 000 r/min的速度离心沉降10 min。取上清液，测定其在210 nm处的紫外吸光度。同时取20 mg不同模板-单体比例的聚合物，向其中加入20mL的蒸馏水作同样处理，取上清液作为参比溶液。

1.2.3 印迹聚合物吸附等温线的测定

具塞锥形瓶中分别加入0.100 g MIP或NMIP和40mL不同浓度的丙烯酰胺溶液，室温振荡24 h，使吸附达到平衡，以5 000 r/min的速度离心沉降10 min。取上清液，测定其在210 nm处的紫外吸光度值。求出吸附达到平衡后的浓度Δe，计算吸附量。吸附量的计算公式为:Q=(co-ce)×V/m×10－3。其中:Q为吸附量(mg/g);co为吸附前溶液中的丙烯酰胺的浓度(μg/mL);ce为吸附达到平衡后的丙烯酰胺浓度(μg/mL);V为吸附液的体积(mL);m为MIP或 NMIP 的质量(g)［11］。

1.2.4 吸附动力学的测定

具塞锥形瓶中分别加入0.100 g MIP和40mL相同浓度的丙烯酰胺溶液，室温分别振荡4、8、12、16、20和24 h，以5 000 r/min的速度离心沉降10 min。取上清液，测定其在210 nm处的吸光度值。计算不同吸附时间下的吸附量，绘制吸附动力学曲线［12］。

2.4.2 Tim-3与TGF-β、Smads mRNA的相关性分析 Tim-3与Smad3呈正相关（r=0.677，P=0.000）、但与Smad7呈负相关（r=-0.446，P=0.006）。Tim-3与TGF-β不相关，差异无统计学意义（r=0.254，P=0.135），见图2。

1.2.5 印迹聚合物的红外光谱分析

分别对MIP和NMIP的结构特征进行红外光谱检测，以获得分子印迹聚合物的结构信息。

2 结果与讨论

2.1 丙烯酰胺的标准工作曲线

以蒸馏水为参比溶液，测定结果表明，丙烯酰胺标准溶液的浓度在0.2～50μg/mL内，测定液的紫外吸光度与其溶液浓度成良好的线性关系。标准工作曲线见图1，回归方程为y=0.095 6x+0.157 3，其中y为丙烯酰胺溶液在210 nm下的紫外吸光度值，x为丙烯酰胺溶液的浓度，单位为μg/mL。

图1 丙烯酰胺标准工作曲线

2.2 优化功能单体与模板分子比例

定义Q(mg/g)表示MIP或NMIP的单位吸附量，定义特异因子Y=QMIP/QNMIP，其大小代表MIP的吸附特异性［13］。不同模板-单体分子比例的 MIP的单位吸附量和特异因子如表3所示。

表1 不同模板－单体比例的MIP的吸附性能

从表1的数据可以看出，3种不同比例的模板与单体分子制备的MIP中，模板与功能单体比为1∶8的MIP无论是单位吸附量还是特异因子都是最好的，所以选择1∶8作为模板与单体的最佳配比，来进行以下的研究。

2.3 静态吸附性能的评价

通过紫外测定，丙烯酰胺的标准工作曲线可以计算出分子印迹聚合物吸附丙烯酰胺的量。以丙稀酰胺的吸附溶液初浓度co(μg/mL)为横坐标，MIP或NMIP的单位吸附量Q(mg/g)为纵坐标，绘制MIP和NMIP的吸附等温线(如图2)。

从图2看出，MIP的单位吸附量明显大于NMIP的单位吸附量，且两者的吸附量之差随溶液浓度的增加而增大，这说明聚合物的空间结构存在明显的差异。其原因是印迹聚合物包含有固定排列的功能基的孔穴，其大小和固定排列的功能基与丙烯酰胺分子互补，孔穴对其呈现出“记忆功能”。这显示了MIP的孔穴效应显著，对目标分析物表现出较强的吸附能力。另外，MIP的吸附容量随着丙烯酰胺分子浓度的增加而增加，当丙烯酰胺的质量浓度低于30μg/mL时，吸附容量增加速度较快。

图2 MIP和NMIP的吸附等温线

2.4 动态吸附性能的评价

通过紫外测定，丙烯酰胺的标准工作曲线可以计算出分子印迹聚合物吸附丙烯酰胺的量。以振荡时间(h)为横坐标，MIP的单位吸附量Q(mg/g)为纵坐标，绘制出MIP的吸附动力学曲线(如图3)。从图3中看出，随着振荡时间的增加，MIP对相同浓度的丙烯酰胺的吸附量也随之增加。当振荡时间小于20 h，MIP的吸附量迅速增加;当振荡时间大于20 h时，MIP的吸附量增加缓慢，到24 h时渐渐趋于平衡。

图3 MIP的吸附动力学曲线

2.5 聚合物的Scatchard分析

式中，Q为吸附平衡时MIP对丙烯酰胺的结合量(mg/g)，c为吸附平衡时溶液中游离的丙烯酰胺的浓度(μg/mL)，Qmax为表观最大结合常数，KD为结合位点的平衡解离常数。

以Q(mg/g)为横坐标，Q/c(L/g)为纵坐标，绘制出图3所示的MIP的Scatchard曲线。其中Q(mg/g)代表单位吸附量，c(μg/mL)代表丙烯酰胺的平衡浓度［14］。从图4中可以看出，Scatchard曲线的线性回归方程为y= －0.361 6x+1.548 6，R=0.973 1。由直线方程计算出MIP对丙烯酰胺的最大吸附量为4.283 mg/g，客体－聚合物的解离常数KD为2.77μg/mL。由上述结果可以看出，KD值较小，说明聚合物对丙烯酰胺的键合能力是较强的。

图4 MIP的Scatchard曲线

2.6 印迹聚合物的红外表征

红外光谱是测定有机化合物的重要物理方法之一，实验采用红外光谱分析法来推断形成的分子印迹聚合物的结构。将MIP和NMIP进行红外光谱表征(溴化钾压片法)，谱图如图5、图6所示。

图5 NMIP的红外光谱

图6 MIP的红外光谱

红外光谱分析表明(如图5、图6)，MIP中的模板分子丙酰胺与功能单体甲基丙烯酸充分作用后，两者的主要官能团的波数发生了变化。由于NMIP中没有模板分子丙酰胺，而无法说明丙酰胺中的—NH伸缩振动波数的移动，但可以看出功能单体甲基丙烯酸中的—OH伸缩振动波数由3 434.04cm－1移动到3 447.88cm－1，C═══O的伸缩振动波数由1 750.03cm－1移动到1 722.60cm－1。甲基丙烯酸的 C ═══O和—OH的峰发生了变化，说明可能是由于丙酰胺和甲基丙烯酸产生了氢键作用。通过红外光谱分析，说明印迹分子的选择特异性可能是由于氢键作用形成的，印迹分子丙酰胺和功能单体甲基丙烯酸可进行自组装形成主客体络合物，通过加入交联剂、引发剂聚合后被固定下来。当丙酰胺被洗脱后MIP留下了与印迹分子结构相似的孔穴，即MIP中通过立体构型和结合位点可对丙酰胺的结构类似物丙烯酰胺进行有效识别。

3 结论

本研究采用虚拟分子印迹技术，以丙烯酰胺的结构类似物丙酰胺为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，合成出对丙烯酰胺有特异选择能力的分子印迹聚合物，振荡吸附试验确定了模板分子与功能单体的最佳摩尔比为1∶8。MIP和NMIP的等温吸附线表明，MIP形成的孔穴对丙烯酰胺的吸附量明显高于NMIP。动力吸附线表明，同样条件下，MIP对相同浓度丙烯酰胺的吸附量在24 h时达到平衡。红外光谱分析出特异性识别位点是由于酰胺键和羧基形成了氢键的作用。Scatchard分析得出聚合物对丙烯酰胺的理论最大吸附量为4.283 mg/g，说明聚合物对丙烯酰胺有较强的吸附性能。

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Study on Preparation and Performances of Acrylamide Molecularly Imprinted Polymers

Quan Ying，Sun Jing，Shen Yang，Zhan Yue-hua，Zhang Gen-hua，Ding Jian-ying，Qin Hong
(Suzhou Key Laboratory of Food Quality and Safety，School of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，China)

The acrylamide molecularly imprinted polymer was synthesized by using propionamide as a template molecular，methacrylic acid as thefunctional monomer，and ethylene glycol dimethacrylate as the cross-linking agent.The optimal molar ratio of templates to monomers was 1∶8.The results of static adsorption equilibrium experiments and scatchard analysis showed:compared with non-imprinted polymer，the imprinted polymer had higher affinity for acrylamide.The max adsorptive capacity was 4.283 mg/g and the dissociation constant(u)was 2.77 g/mL.The infrared spectrum of the polymer indicated that the specific recognition sites in the molecular imprinted polymer were due to the hydrogen bonding effect formed by amide bonds and the carboxyls.

acrylamide，molecular imprinting，adsorption

博士，副教授(张根华教授为通讯作者)。

*江苏省六大人才高峰资助项目(SZ2010003);苏州市农业科技公关项目(SNG0836);苏州市社会发展项目(SZD0927)

2010－06－20，改回日期:2010－10－01