离子交换色谱-积分脉冲安培法测定大蒜中的蒜氨酸*

李存芝，黄雪松

(暨南大学食品科学与工程系，广东广州，510632)

离子交换色谱-积分脉冲安培法测定大蒜中的蒜氨酸*

李存芝，黄雪松

(暨南大学食品科学与工程系，广东广州，510632)

为测定新鲜大蒜中蒜氨酸，采用离子交换色谱-积分脉冲安培(IEC-IPA)分析法，以离子交换分离柱分离，积分脉冲安培电化学检测，柱温:30℃;流动相:离子水、250 mmol/L NaOH及1mol/L醋酸钠进行梯度洗脱;流速:0.25mL/min。测得结果:蒜氨酸保留时间为5.100～5.200 min，浓度在0.45～3.0μg/mL内线性关系良好，相关系数0.997 9，检测限0.05μg/mL，加样回收率为96.7%，标准差1.7%;测得的广东蒜及山东蒜的蒜氨酸含量分别是1.262 9%、1.511 4%。

大蒜(Allium sativum L.)，蒜氨酸，离子色谱法，积分脉冲安培检测

大蒜(Allium sativum L.)是百合科葱属植物蒜的鳞茎，含有丰富的营养物质［1］。据报道新鲜大蒜中含有大量大蒜素的前体物质——蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜)［2］。研究亦表明，蒜氨酸是大蒜中的主要活性成分，具有抗氧化、清除自由基、降脂、抗肿瘤、抗血栓等多项功能［3］。所以测定蒜氨酸的含量已成为评定大蒜及其制品品质的重要指标。

由于大蒜成分的多样性和不稳定性，直接测定蒜氨酸含量存在一定困难，且各种分析结果有很大差异，至今尚未有统一的标准方法测定大蒜中蒜氨酸含量。传统的定硫法精确度极低;薄层扫描法［4］、高效液相色谱法［5～8］、液质联用法［9］、高效毛细管电泳法［10］、4-MP［11］测定法、高效离子对色谱法［12］、柱前或柱后衍生化后测定［13］等方法前处理复杂，检测周期长，或需特殊的仪器，在应用中受到限制。

离子交换色谱(IEC)法对于分离氨基酸类物质具有柱效高、分离效果好的特点，积分脉冲安培检测器(IPA)是一种氧化还原检测器，对于含有硫原子的蒜氨酸应当具有较好的响应。因此，本文探讨离子交换色谱-积分脉冲安培(IEC-IPA)法用于测定蒜氨酸的可行性。

1 材料与方法

1.1 原料和试剂

新鲜广东大蒜和山东大蒜，购于广东石牌蔬菜市场。

250 mmol/L NaOH 溶液(Fisher公司，美国)，1mol/L醋酸钠(戴安公司，批号050205)，超纯水(蒸馏水再经过Millipore超纯水系统制备)，合成蒜氨酸［13］(自制)，无水乙醇，双蒸水。

1.2 样品配制

1.2.1 合成蒜氨酸溶液的配制

精密称取22.5 mg蒜氨酸，用体积分数20%乙醇定容至25mL，使之成为900μg/mL的蒜氨酸母液，以此溶液作倍比稀释及3∶2倍稀释，配制成600、450、300、225、112.5μg/mL 的系列标准溶液。然后，再用超纯水将上述浓度的标准液分别稀释到3、2.25、1.125、0.9、0.6、0.45μg/mL，用 0.2 μm 滤膜过滤进样。在离子交换色谱条件下分析蒜氨酸的标准溶液，并绘制溶液的标准工作曲线。

1.2.2 不同大蒜样品液的制备

称取购自农贸市场的新鲜、去皮的广东金山火蒜或山东金乡大蒜各30.00 g，加入50mL的水，微波煮沸5 min，研钵研碎，无损失地转移到100mL容量瓶中定容，摇匀后离心过滤(4 000 r/min，20 min)，取上清液用超纯水稀释至100倍，用0.2 μm一次性滤头过滤后，吸取0.25μL进样，测定样品中的蒜氨酸。

1.3 IEC-IPA测定条件

ICS-2500型离子色谱仪(戴安公司，美国)，主要配置:含在线脱气装置的四元梯度泵GP50、柱温箱LC30、淋洗液自动发生器EG50、脉冲安培电化学检测器ED50(Au为工作电极，Ag/AgCl为参比电极)、离子交换色谱柱(即氨基酸分离柱，Amino PACPA10，2 mm ×250 mm)，氨基酸保护柱(Amino PAC PA10，2 mm ×50 mm)，柱温:30℃，流速:0.25mL/min，进样量:0.25μL，流动相 A:去离子水，流动相B:250 mmol/L氢氧化钠溶液，流动相C:1mol/L醋酸钠，用上述3种流动相进行梯度洗脱，详细梯度淋洗程序见下表1，结果分析采用Chromeleon 6.0工作站。

表1 离子色谱梯度淋洗程序(体积分数)

2 结果与分析

2.1 17种常见标准氨基酸的离子色谱图

图1是利用IEC-IPA法分析的17种常见标准氨基酸的离子色谱图，由图1可见IEC-IPA法对17种常见氨基酸的分离效果较好。

图1 17种常见标准氨基酸的离子色谱图

2.2 合成蒜氨酸的离子色谱图

图2是合成蒜氨酸的离子色谱图，其保留时间为5.200 min，其含有少量的精氨酸(1.175 min)杂质。比较图1与图2的色谱峰可以看出，在本实验条件下，蒜氨酸(5.200 min)不会与相邻的赖氨酸(3.517 min)、丙氨酸(6.15 min)色谱峰重合，即蒜氨酸与其他氨基酸混在一起时，仍可以取得较好的分离效果。

图2 合成蒜氨酸的离子色谱图

2.3 线性关系的考察

测定上述1.2.1项配制的标准溶液，进样量均为5μL。以标准溶液质量浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，建立标准曲线。得出合成蒜氨酸的工作曲线为Y=36.397 X+1.903 7，相关系数r=0.997 9，表明蒜氨酸在质量浓度在0.45～3.0μg/mL时，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.4 检测限和精密度

分别精确量取上述1.2.1项中配制的蒜氨酸标准溶液(0.45μg/mL)1mL，置于5mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，进样量5μL。以信噪比S/N=5计，蒜氨酸的检测限为0.05μg/mL。将上述标准溶液重复进样5次，测得峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.7%。该检测限较用紫外检测等方法要低得多［14］，这是因为积分脉冲安培检测器是一种氧化还原型检测器，蒜氨酸具有较好的氧化还原性，因而对该类检测器具有较好的响应，所以，检测限较低。

2.5 蒜氨酸回收率的测定

在供试品溶液中加入已知量的合成蒜氨酸，进行回收率测定，测定结果(表2)表明其回收率一般为95.5%～98.8%，可见，其回收率较高。

2.6 广东蒜及山东蒜中蒜氨酸含量测定

图3和图4分别是广东蒜及山东蒜的蒜氨酸色谱图，其酸氨酸的保留时间分别是5.200和5.185 min，与图2中合成标准蒜氨酸的保留时间(5.200 min)基本一致，其微小差异应为进样误差所致。

所测广东蒜及山东蒜样品的蒜氨酸含量见表3。

表3表明，不同产地的大蒜中蒜氨酸含量差异较大;山东大蒜的酸氨酸含量远远高于广东蒜，这可能与广东蒜生长季节短、含水量相对较高有关。

表2 回收率试验结果

表3 广东蒜及山东蒜样品的蒜氨酸含量

图3 广东蒜的蒜氨酸色谱图

图4 山东蒜的蒜氨酸色谱图

3 结论

利用IEC-IPA法测定大蒜样品中的酸氨酸，线性范围为0.45～3.0μg/mL，检测限低至 0.05μg/mL，可以同时测定其他氨基酸。该法简便、快速、准确、分离效果好。

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Ion-exchange Chromatography-integrated Pulsed Amperometric for Determination of Alliin

Li Cun-zhi，Huang Xue-song
(Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

To develop ion-exchange chromatography-integrated pulsed amperometric(IEC-IPA)method for the determination of alliin in fresh garlic.The IEC-IPA conditions were:ion-exchange separation column，an integrated electrochemical pulsed amperometric detector，column temperature:30℃，mobile phase:deionized water、250 mmol/L NaOH and 1mol/L NaAC，flow rate was at:0.25mL/min.The result showed that good relationship was linear in the range of 0.45～3.0μg/mL(r=0.997 9)alliin concentration.The limits of detection were 0.05μg/mL.The recovery was 96.7%and relative standard deviations was less than 1.7%.The retention time of alliin is 5.100～5.200 min.And the alliin content of Guangdong and Shandong Garlic are 1.262 9%、1.511 4%respectively.We concluded that IEC-IPA method has good separation efficiency for detection of alliin.This method is sensitive，simple，rapid and the results are good，accurate and reliable.IEC-IPA is suitable for determining the alliin in garlic and its products.

garlic(Allium sativum L.)，alliin，ion chromatography，integrated pulsed amperometric detector

博士，讲师。

*国家高技术研究发展计划专项经费(2007AA10Z300)和国家自然科学基金(30671472)资助

2010－02－15，改回日期:2010－10－11