紫山药多糖酶法提取工艺优化研究

汪财生,孙安吉,王忠华,游广宇

(浙江万里学院生物与环境学院,浙江宁波 315100)

紫山药多糖酶法提取工艺优化研究

汪财生,孙安吉,王忠华,游广宇

(浙江万里学院生物与环境学院,浙江宁波 315100)

采用正交实验优选紫山药多糖传统热水浸提法工艺参数,并在此基础上进行纤维素酶法提取紫山药多糖工艺参数研究,结果表明,传统水浸提法最佳工艺参数为温度80℃,提取时间 160min,加水倍数60mL/g,粗多糖平均得率为5.65%;纤维素酶法提取最佳工艺参数为水提温度 40℃、pH5、加酶量 0.50%,粗多糖平均得率为 8.51%,较热水浸提法提高了 1.51倍。因此,纤维素酶法工艺更适用于紫山药多糖的提取。

紫山药,多糖,纤维素酶

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫山药 2007年 11月购于浙江省台州市杜桥农贸市场,挑选当年采收,新鲜无腐烂,自然晾干的块状“糊芦”根茎,将紫山药洗净,去皮切成约 3mm的薄片,于 60℃鼓风干燥箱下烘干,万能粉碎机粉碎过 80目筛后保存于二氧化硅干燥器备用;纤维素酶 酶活力≥30U/mg,浙江微生物试剂有限公司;无水乙醇、苯酚、浓硫酸等 均为分析纯。

UV240紫外可见分光光度计 日本岛津;RE52-4旋转蒸发器 上海泸西分析仪器厂有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 传统热水浸提法工艺流程 紫山药粉末→按比例加入蒸馏水浸提 2h→热水浸提→4000r/min,离心 8min→沉淀再提取→合并提取上清液→真空减压浓缩→去蛋白→60%乙醇沉淀→复溶后 95%乙醇洗涤,重复三次→无水乙醇洗涤沉淀多糖→低温减压干燥→紫山药粗多糖

1.2.2 纤维素酶法水提紫山药多糖工艺流程 紫山药粉末按传统热水浸提法正交优化的加水倍数加入蒸馏水浸提 2h,加入纤维素酶,在传统热水浸提法正交优化的时间内按设计温度酶解后,4000r/min,离心8min,弃沉淀,上清液真空减压浓缩,后续操作同 1.2.1。

1.2.3 多糖含量的测定 准确称取一定量粗多糖样品,以葡萄糖为标准品 (用 0.9的系数校正),采用苯酚一硫酸比色法测定多糖总量[3],得回归方程 C= 0.0242A+0.0039,R2=0.9989,多糖测定方法有效,同一样品用 DNS比色法测定还原糖[4],得回归方程Y=3.0176X-0.0408(R2=0.9993),还原糖测定方法有效。

多糖含量 =总糖含量-还原糖含量

紫山药多糖得率(%)=多糖含量(g)/紫山药粉末质量(g)×100%

2 结果与分析

2.1 传统水提法工艺参数

2.1.1 影响传统水提法的单因素实验 紫山药粉末各 50g于烧杯中,在传统热水浸提法设计工艺基础上,以紫山药多糖得率为指标进行单因素实验分别考察各因素对传统热水浸提紫山药多糖的影响,即水浴温度 (50、60、70、80、90℃)、提取时间 (80、120、160、200、240min)、加水倍数 (20、40、50、60、70、80mL/g)。结果如图 1所示,多糖得率随水浴温度升高而呈现缓慢升高趋势,至 80℃时多糖得率达4.78%,以后趋于平缓,表明一定的水浴温度对紫山药多糖的提取有一定的影响,紫山药细胞壁膨胀破裂,加速了多糖的溶出;由图 2可知,水浴提取时间越长多糖得率越高,提取 120、160、200min的多糖得率分别为 5.38%、5.90%、5.79%,提取一定时间后该种方法对多糖的提取已基本完全,为了用较少的时间和人力资源,得到丰富的可供分析的实验数据,故后续实验确定其最佳浸提时间为 160min;由图 3可看出,随着加水倍数的增大,多糖得率呈现上升趋势,至加水倍数为 60mL/g时出现峰值,多糖得率为5.13%,之后随加水倍数增大,造成浓缩操作中多糖损失,多糖得率略有平缓下降。

图 1 热水浸提法温度对多糖得率的影响

图 2 水提法时间对多糖得率的影响

图 3 热水浸提法加水倍数对多糖得率的影响

2.1.2 正交实验设计确定传统水提法工艺 在上述2.1.1单因素实验结果基础上,采用三因素三水平L9(33)的正交实验设计优化传统水提紫山药多糖的工艺参数,根据因素水平分组实验,每组称取紫山药粉 10g,按设计工艺提取多糖,结果见表 1。

表 1 水提法L9(33)正交优选设计及结果

正交实验方差分析表明,从极差结果得出影响传统水浸提取因素大小依次为 RA＞RB＞RC,即为水浴温度 ＞提取时间 ＞加水倍数。表 2方差分析表明温度因素对水提法提取紫山药粗多糖影响极显著(P≤0.01);时间、加水倍数因素对水提法提取紫山药粗多糖影响不显著。因此,最佳提取条件为A2B2C2,即温度 80℃,提取时间 160min,加水倍数60mL/g为最佳提取条件。

2.2 纤维素酶解水提法工艺参数

2.2.1 酶解水提法的单因素实验 称取紫山药粉末各 50g于烧杯中,参考文献[5-6]报道及在传统热水浸提法正交实验设计最佳工艺的基础上,以紫山药多糖得率为指标进行单因素实验分别考察各因素对酶解水提紫山药多糖的影响,即酶解温度 (30、40、50、60、70℃)、pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、加入山药干重酶量 (0.40%、0.45%、0.50%、0.55%、0.60%)。结果如图 4所示,多糖得率随酶解温度升高而呈现缓慢升高趋势,至 40℃时纤维素酶活力表现最强,多糖得率达 8.19%,之后随温度升高而有显著下降趋势;研究pH对酶解法提取紫山药粗多糖的影响。由图5可知,pH4.5时纤维素酶活力表现最强,多糖得率达6.94%,之后随pH升高而有显著下降;酶量对提取紫山药粗多糖的影响如图 6所示,随着加酶量的增加,多糖得率显著升高,当酶量达到 0.50%时多糖得率达7.96%,之后趋向平稳,多糖得率变化不明显,表明一定的酶量已完全将山药细胞壁酶解。酶量、温度、pH单因素实验结果表明与纤维素酶活力特征相符合。

表 4 纤维素酶法水提多糖正交实验方差分析结果

表 2 水提法正交实验的方差分析结果

图4 酶解温度对多糖得率的影响

图5 酶解pH对多糖得率的影响

图6 加酶量对多糖得率的影响

2.2.2 正交实验设计确定纤维素酶法水提工艺参数

为了与传统水提比较,纤维素酶解在浸提过程中,在 2.2.1单因素实验结果基础上,采用三因素三水平L9(33)的正交实验设计优化酶解水提紫山药多糖的主要工艺参数,根据因素水平分组实验,每组称取紫山药粉 50g,按设计工艺提取多糖,结果见表 3。

表 3 纤维素酶法水提多糖L9(33)正交优选设计及结果

正交实验极差分析发现,由极差 R得出影响因素大小顺序为 A＞C＞B。表 4方差分析表明温度因素对酶解提取紫山药粗多糖影响极显著 (P≤0.01); pH、酶量因素对提取紫山药粗多糖影响不显著。由此得出最佳提取工艺为A2B2C2,即在酶法提取紫山药粗多糖时选择最佳条件为 40℃、pH5、酶添加量为0.50%。

2.3 两种提取方法比较

图7 热水浸提法与纤维素酶法提取紫山药粗多糖、还原糖得率的比较

按上述传统水提及纤维素酶解正交实验结果条件下,重复 1.2.1及 1.2.2步骤提取紫山药粗多糖,结果如图 7所示,传统热水浸提法平均粗多糖得率为5.65%,纤维素酶解水提法粗多糖得率为 8.51%,酶解法比水提法多糖得率显著提高 50.62%(P≤0.01),而还原糖量未有明显变化。表明紫山药细胞壁的主要成分是纤维素,恰当地利用纤维素酶处理,可使细胞壁软化、膨胀和崩溃,从而可改变细胞壁的通透性,提高细胞内含物(蛋白质、淀粉、糖等)的提取率。提示紫山药多糖以酶法提取为佳,而且省略热水浸提步骤,减少了提取工艺中能耗。

3 结论

本实验研究表明,传统热水提法最佳提取工艺参数为温度 80℃,提取时间 160min,加水倍数 60mL/ g;纤维素酶法最佳提取工艺参数为温度 40℃、pH5、酶量 0.50%。纤维素酶法提取紫山药粗多糖的提取率比热水法浸提的粗多糖得率提高了 1.51倍,而且所提取的紫山药粗多糖色泽为灰白色,质量佳,纤维素酶可用来提取紫山药多糖。用纤维素酶法提取得到的紫山药粗多糖,由于滤渣中还有残余的多糖,通过增加提取次数及在水浸提前加入催化剂 (如ZnCl2、MgCl2)作用下对原料进行酶预处理,还可提高多糖得率。

[1]黄芳,蒙义文 .活性多糖的研究进展[J].天然产物研究与开发杂志,1999(2)：90-98.

[2].杨永庆 .红紫山药[J].农村百事通,2006,18：30-31.

[3]萧能庚,余瑞元,袁明秀,等 .生物化学实验原理和方法[M].北京：北京大学出版社,2005：194-196.

[4]陈毓荃 .生物化学实验方法和技术[M].北京：科学出版社,2002：97-99.

[5]孟庆华,刘钟栋,陈肇锬,等 .怀山药多糖的提取[J].食品工业科技,2005(2)：126-128.

[6]王晖,刘佳佳 .银杏黄酮的酶法提取工艺研究 [J].中药材,2003,26(12)：887.

Study on optimization of enzymatic extration polysaccharide from purple yam

WANG Ca i-sheng,SUN An-ji,WANG Zhong-hua,YOU Guang-yu
(College ofBiological and Environmental Sciences,ZhejiangWanliUniversity,Ningbo 315100,China)

Based on theeffec t on thec rude p olysaccha rideextrac ted by wa te r trea tm ent a t the orthogona l exp e r im ent in p urp le yam,the extrac tion cond itions of ce llulose enzym e m e thod was a lso inves tiga ted in this s tudy.The results showed tha t the op t im um extrac ting cond ition of d iffe rent m e thod was as follows：ba thing temp e ra ture a t80℃,extrac tion t im e for160m in,the ra tion of solid to liquid1∶60in the wa te r ba thing m e thod and ce llulose am ount of0.50%,the ba thing temp e ra ture a t40℃,pH va lue of5.0in the ce llulose enzym e m e thod.Unde r these two cond itions,the p olysaccha ride extrac tion ra te was 5.69% and 8.51%,resp ec tive ly.The ra te of p olysaccha ride extrac ted by ce llulose enzym e m e thod was1.51t im es of tha t extrac ted by the wa te r trea tm ent m e thod.The refore,the ce llulose enzym e m e thod is m ore suitab le for the extrac tion of p olysaccha ride from p urp le yam.

p urp le yam;p olysaccha ride;ce llulose enzym e

TS201.2

B

1002-0306(2010)02-0266-04

多糖广泛存在于许多动植物体内,不仅是生物的营养成分,而且还参与多种生命活动。随着人们对传统中药研究的不断深入,陆续有一批从植物中提取的活性多糖成分被发现,而且已经研究表明,植物中分离得到的多糖类物质能激活免疫细胞,诱发产生许多能提高机体免疫能力的重要细胞因子,从而起到抗肿瘤、抗炎症、抗感染及抗衰老等作用[1]。因此,活性多糖提取及功效研究已经成为生物医药研究的重要内容之一。紫山药,也称紫山芋,属薯蓣科植物薯蓣 (D ioscorea oppositathunb)的干燥根茎;我国云南、贵州、江苏、浙江、河南等地都有大面积种植。紫山药含有大量的蛋白质、多糖及淀粉等较高营养物质。据《本草纲目》记载,有滋肺益肾,健脾止泻,对脾虚腹泻、久痢不愈、虚痨咳嗽、肾虚遗精、小便频繁等有一定的食疗作用,且食味鲜美[2]。日本、台湾等地从国内引进后,已有紫山药活性成分提取及开发的产品,如保健饮料、保健胶囊等产品,而我国对紫山药开发尚属空白,尤其是紫山药主要活性多糖成分提取及功效未曾有文献报道。笔者对紫山药营养成分、薯蓣皂苷前期研究 (另文报道)时,发现紫山药活性多糖具有很强的抗氧化功能,而且含量丰富。酶工程技术是近年来用于天然植物有效成分提取的一项生物工程技术,而国内外将酶用于紫山药多糖提取迄今未见报道。本研究将纤维素酶用于紫山药多糖的提取,以粗多糖得率为定量指标,先将酶法与传统热水浸提方法进行比较,并进一步采用正交实验法对酶法提取工艺进行优选,为制定科学、经济的生产工艺提供参考。

2009-03-18

汪财生(1969-),男,高级实验师,研究方向：活性物质提取分离。