新生隐球菌基因组DNA不同抽提方法的比较

邹先彪廖万清温海吴建华仇芸杨金水

(1.北京市解放军总医院304临床部皮肤科,北京100048;2.第二军医大学长征医院皮肤科,上海200003; 3.第二军医大学长海医院皮肤科,上海200433;4.复旦大学遗传所,上海200433)

新生隐球菌基因组DNA不同抽提方法的比较

邹先彪1,2廖万清2温海2吴建华3仇芸2杨金水4

(1.北京市解放军总医院304临床部皮肤科,北京100048;2.第二军医大学长征医院皮肤科,上海200003; 3.第二军医大学长海医院皮肤科,上海200433;4.复旦大学遗传所,上海200433)

目的DNA是进行分子生物学研究的重要基础。在本研究中,我们建立了2种简单快速抽提基因组DNA的方法并可用作PCR扩增的模板。通过比较4种不同的DNA抽提方法以确定哪种更适合进行下一步的基因分析。方法 这4种方法是:玻璃珠法,酶法,3%SDS法和氯化苄法。玻璃珠法是用玻璃珠在混漩器上剧烈振荡破碎细胞壁;3%SDS法是将细胞在含10 mmol/L DTT的3%SDS溶液中加热,然后用5 mmol/L KAc和异丙醇抽提,DNA的产量通过A260测定。结果3%SDS溶解法、经典酶法、玻璃珠法和氯化苄法的DNA产量分别为0.415 4±0.036 7、0.848 4±0.075 6、1.263 6±0.204 0、0.407 0±0.033 9(g/L×108CFU/mL)。结论 玻璃珠法是最敏感、重复性好、简单、费用合理的抽提方法。

新生隐球菌;DNA抽提;方法

新生隐球菌是具荚膜的担子类酵母,容易在免疫缺陷患者中引起新生隐球菌脑膜炎,有很高的死亡率[1]。基因技术的广泛应用,使新生隐球菌的研究达到了一个更新更深的层次,而基因技术的关键是核酸的分离,新生隐球菌由于除具有一般真菌所具有的细胞壁以外,还有一般真菌所不具有的厚荚膜,常规抽提核酸的方法是用酶消化细胞壁和荚膜形成原生质体后再破壁抽提,而这个过程往往比较烦琐。基于这个难点,我们尝试建立了快速抽提基因组DNA的方法,并比较了玻璃珠法,酶法,3% SDS法和氯化苄法四种不同的DNA抽提方法,现将我们的结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

新生隐球菌Cap60无荚膜突变株(美国McGurire Veterans Administration Medical Center, Richmonel,Virginia 23249的ES.Jacobson教授惠赠);新生隐球菌YD2,YD10(意大利米兰大学卫生和预防医学所真菌实验室惠赠,中国真菌菌种保藏中心隐球菌专业实验室保存);紫外凝胶成像仪(上海复日生物技术研究所);U-3000 Spectrophometer(日本岛津公司);Perkin-Elmer Cetus 9600 ther mal Cycler(美国PE公司);氯化苄(购自上海化学试剂商店);NovoZyme234,0.45～0.55 mmol/L Glass beads,Dithiothreitol(DTT)(Sigma公司); Taq DNA polymerase(购自上海生工生物技术工程公司)。YPD培养基(2%蛋白胨,2%葡萄糖,1%酵母抽提物);玻璃珠法抽提缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl pH8.0,10 mmol/L EDTA pH8.0,5 mmol/ L DTT,100 mmol/L NaCl,1%SDS);3%SDS法抽提缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl pH7.5,10 mmol/L Na2EDTA pH8.0,10 mmol/L DTT,3%SDS);氯化苄法抽提缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl,pH9.0,40 mmol/L EDTA)。

1.2 方法

菌种繁殖和原生质体的制备[2]

玻璃珠法快速抽提基因组DNA 1 mL YPD菌体培养液置于1.5 mL管中,10 000 r/min离心2 min收获菌体;用双蒸水洗涤两次,同法离心,弃上清;加入200μL的玻璃珠抽提缓冲液,充分混匀,置于37℃摇床孵育10 min;加入等体积的酸洗玻璃珠(约200μL),高速振荡1 min,冰浴30 s,重复5～6次,加入400μL不含1%SDS的玻璃珠抽提缓冲液,手摇混匀;12 000 r/min离心2 min,将上清转至另一干净的管中;加入RNase A使其终浓度达0.5 mg/mL,50℃水浴20 min;然后加入等体积的酚氯仿,手摇混匀,12 000 r/min 10 min;取上清再以等体积的氯仿同法离心1次;将上清转至另一干净的Eppendor管中,加入1/10体积的3 mol/L NaAc(pH5.2)和等体积的异丙醇,来回颠倒数次混匀,-20℃放置20 min;室温下12 000 r/min离心10 min,弃上清,沉淀以70%的冷乙醇洗涤3次,风干后加入适量的双蒸水,放置4℃C备用。

3%SDS法快速抽提基因组DNA 1 mL的YPD培养液的菌体置于1.5 mL管中,10 000 r/min离心2 min收获菌体;加入双蒸水洗涤2次,10 000 r/min离心2 min,弃上清;沉淀中加入150μL的3%SDS抽提缓冲液,充分混匀;50℃水浴20 min,其间轻轻来回颠倒数次或手指轻弹管壁数次,加入TE缓冲液450μL颠倒混匀;加入2/5体积冰冷的5KAc,冰浴10 min;12 000 r/min离心5 min,将上清转至另一干净的管中;同法重复离心一次;加入等体积的异丙醇,轻轻来回颠倒数次混匀,-20℃放置10 min;12 000 r/min离心10 min,弃上清;沉淀以70%的冷乙醇洗涤3次,风干后加入适量的双蒸水溶解DNA沉淀,放置4℃备用。

氯化苄法抽提基因组DNA[3]

酶法抽提基因组DNA[4]每种方法重复5次,将上述抽提的基因组DNA经纯化后,测定其A260/A280比值,计算DNA含量=A260×50μg×稀释倍数×样品总体积,数据经SPSS 10.0随机取组方差分析软件处理。

PCR鉴定DNA质量 以引物对CAP64-P1和CAP64-P2扩增新生隐球菌荚膜相关基因CAP64的一段编码序列,引物由上海基康生物工程公司合成。CAP64-P1:cgccaagggagtcttatat,CAP64-P2:agtaaatagccacatcgccc,反应体积:10 mmol/Lol/L dNTP 1μL,10×PCR buffer 5μL,5 u/μL Taq 0.5μL, CAP64-P1 2.5μL,CAP64-P2 2.5μL,25 mmol/ Lol/L MgCl23μL,DNA 10 ng,ddH2O 33μL,总体积50μL。反应条件:94℃预变性4 min,94℃1 min,55℃1 min,72℃2 min,35个循环,循环结束后,72℃延伸10 min。在0.8%琼脂糖凝胶(含0. 5μg/mL的溴化乙锭)电泳分离PCR产物,紫外灯下观察,在紫外凝胶成像仪下照相。

2 结 果

实验结果表明:玻璃珠法的DNA产量显著高于其他3组(P<0.05),酶法的DNA产量显著高于氯化苄法和3%SDS法(P<0.05),氯化苄法和3%SDS法的DNA得率无显著性差异(P>0. 05,见表1)。

4种方法抽提的DNA经PCR后获得一致的结果(见图1)。

3 讨 论

新生隐球菌基因组DNA快速抽提方法的建立和不同抽提方法的比较:由于单个酵母细胞中基因组所含的DNA的量小,仅为人白细胞中单倍体基因组DNA量的1/100,加之新生隐球菌具有荚膜和细胞壁的双重屏蔽作用,给提取DNA带来困难[5-7],我们用无荚膜株抽提DNA,其产量比有荚膜的高。也说明荚膜对DNA的抽提有影响。DNA抽提的关键步骤是破壁,早期的真菌破壁一般采用液氮冷冻研磨,超声破壁或冷冻干燥研磨,由于剧烈的机械损伤,而致大量的DNA分子断裂[8-9]。后来又相继发展了酶法、氯化苄法、异硫氰酸法、CTAB法等[3,10-12],也产生了较好的效果。异硫氰酸是一种强烈的变性剂,有破坏植物和真菌细胞壁的功能,现已广泛用于许多微生物的DNA和RNA的抽提;CTAB是一种去污剂,有去荚膜的作用,能与核酸形成复合物,这种复合物在高盐溶液中可以溶解并稳定存在,而在低盐溶液中会因溶解度的降低而沉淀下来;氯化苄法是由朱衡发明的一种新的抽提DNA的方法,其原理是利用细胞壁的N-乙酰基葡萄糖胺的糖链上含有大量的羟基这一特点,而氯化苄在碱性条件下可与羟基作用生成乙醚,由此可以破坏细胞壁而使细胞内的DNA释放出来[3,10-11]。在我们用氯化苄法抽提DNA的过程中,发现其得率并不比酶法的高,可能是因为新生隐球菌有荚膜和细胞壁的双重保护作用的关系,因此,国外有学者在用此法时加用玻璃珠进行简短地破壁处理[13],但在新生隐球菌DNA抽提过程中,有荚膜株的核酸抽提中往往会同时伴随着大量的碳水化合物(carbohgdrate)沉淀,这主要是因为新生隐球菌荚膜多糖的高产率所致。这时常需用氯化铯密度梯度离心进一步纯化DNA。新生隐球菌因具很厚的荚膜,故目前常用的抽提DNA的方法多需先采用酶消化处理。但其中即使NovoZyme234酶处理细胞壁一般也需1～2 h,而其间菌体本身所含的DNase将降解基因组DNA,这种效应将随着酶解时间的延长而增加。此外,不同的新生隐球菌株产生的细胞外DNase的产量不同,所得到的DNA量亦不同。荚膜株的DNA低产率可能与DNase的产量有关[14-15]。酶法提取新生隐球菌DNA的关键步骤是原生质体的形成。为取得原生质体,我们改良了原生质体形成法,先用二硫苏糖醇(DTT)作予处理以破坏细胞壁的二硫键再用酶消化破壁,这样可以获得较高的原生质体形成率;又因新生隐球菌可以产生细胞外DNA酶,会降解抽提过程中的DNA,因此在收获菌体和原生质体时应至少用ddH2O洗涤2次,以便尽可能多的去掉隐球菌自身的DNA酶,而维持高浓度的EDTA可以对新生隐球菌产生的DNase有抑制作用[16]。

表1 不同抽提方法的新生隐球菌DNA的得率(1×108CFU/mL)Tab.1 DNA production extracted fromC.neofor m ans(1×108CFU/ mL)by differentmethods

图1 4种DNA抽提方法PCR扩增的结果(lane 1.3%SDS法,lane 2.玻璃珠法,lane 3.酶法,lane 4.氯化苄法,lane M.Marker 2000)。引物对CAP64-P1和CAP64-P2可产生一条大约550 bp的条带Fig.1 Amplification of extracted DNA by different methods(lane 1. 3%SDSmethod,lane 2.glass beads method,lane 3.lytic enzyme method,lane 4.benzyl chloride method,laneM.Marker 2000).Approximately 550 bp(primer toCAP64-P1 andCAP64-P2)

为了解决酶消化细胞壁和DNA被降解这一矛盾,我们利用玻璃珠可以破坏真菌细胞壁这一原理[4]建立了一种非酶处理快速抽提新生隐球菌基因组DNA的方法,该方法采用玻璃珠振扰法直接破壁,既避免了基因组DNA被隐球菌内在的DNaseI降解,又大大地节省了时间,整个抽提过程1 h左右;1×108CFU/mL菌体所获DNA量足够酶切和PCR之用;如果DNA在-20℃过夜沉淀,则DNA得率会更高些。由于酶法抽提中NovoZyme234酶价格昂贵,而玻璃珠经反复洗涤后可以重复利用,亦节省了实验费用。此法所用试剂简单,抽提过程快捷,无需特殊设备,既可微量抽提,亦可大量抽提,在一般实验室即可完成,特别适合用于临床的快速检测。在3%SDS方法中,我们借鉴了3%SDS可以直接对细菌破壁的原理[16],经过摸索条件建立了一种适合新生隐球菌基因组DNA抽提的方法,尽管DNA得率比玻璃珠法和酶法低,与氯化苄法没有显著差异,但该法抽提方法简单,在4种抽提方法中费用最为节省,整个抽提过程无需酶和酚氯仿,抽提DNA用1～2个Eppendorf管即可完成,既减少了样品间交叉污染又可减少靶DNA的丢失。产量足够用于PCR分析之用,适用于大规模地抽提新生隐球菌DNA。我们知道SDS是阴离子去污剂,它除了可以溶解蛋白质和脂肪外,还可以解聚核蛋白,SDS可与蛋白质带正电的侧链结合成复合物,从而将核酸和蛋白质分离开,当加入高浓度的KAc溶液时,便可使SDS-蛋白质复合物沉淀下来,同时使多余的SDS转化成溶解度很小的钾盐一起沉淀下来。在上述四种抽提方法中,对所用菌株应取对数生长期的细胞为宜,菌龄老化的细胞会严重影响DNA的得率。

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Comparative study of extraction methods for genom ic DNA ofCryptococcus neoform ans

ZOU Xian-biao1,2,L IAO Wan-qing2,WEN Hai2,WU Jian-hua3,Q IU Yun2,YANG Jin-shui4
(1.Departm ent of Der m atology,304th Hospitol Affiliatedto PLA General Hospital,B eijing100048,China;2.Departm ent of Der m atology,ChangzhengHospitol,TheSecondM ilitaryM edicalUniversity,Shanghai200003,China;3.Departm entof Der m atology,Changhai Hospitol,The Second M ilitary M edical University,Shanghai200433,China;4.Insititute of Genetic of Fudan University,Shanghai200433,China)

ObjectiveTo establish simple and rapid methods for extracting genomic DNA fromC.neofor m ans.To compare and search the better one for gene analysis.M ethods Glass beadsmethod,classical lytic enzyme treatment,3%SDS lysis and the benzyl chloride method were set up and compared.In glass beadsmethod,cellswere broken by vigorouslymixingwith glass beads on a votorex;In 3%SDSmethod,cellswere heated in 3%SDS extraction buffer containing 10 mmol/L DTT for20 minutes.The lysatewas extracted with 5 mmol/L KAc and isopropanol.Yield ofDNA was calculated from the A260 for clean DNA.Results DNA production by 3%SDS lysis,classical lytic enzyme treatment,glass beadsmethod and the benzyl chloride method was 0.415 4±0.036 7,0.848 4±0.075 6,1.263 6±0.204 0,0.407 0±0.033 9(g/L×108CFU/mL)respectively.Conclusions Glass beads method was more sensitve,reproducible,simple and cost-effective forDNA extraction.

Cryptococcus neofor m an;DNA extraction;methods

R 379.5

A

1673-3827(2010)02-0109-04

2010-02-11

[本文编辑] 施 慧

国家自然科学基金(39770002).

邹先彪,男(汉族),博士,副主任医师.E-mail:xbzou@ 126.com

[Chin J Mycol,2010,5(2):109-112]