正交试验优选风湿Ⅱ号合剂提取工艺

朱海涛，管群，陈黎，袁胜浩，杜士明（.郧阳医学院附属太和医院，十堰市44000；.郧阳医学院药学系，十堰市44000）

正交试验优选风湿Ⅱ号合剂提取工艺

朱海涛1＊，管群2，陈黎1，袁胜浩1，杜士明1（1.郧阳医学院附属太和医院，十堰市442000；2.郧阳医学院药学系，十堰市442000）

目的：优选风湿Ⅱ号合剂最佳提取工艺。方法：采用煎煮、微波提取、超声提取3种方法提取药材，以绿原酸与哈巴俄苷含量、浸膏得率为评价指标，筛选出最佳提取方法，再采用正交试验优选出最佳提取工艺。结果：最佳提取方法为煎煮法；最佳提取工艺为12倍加水量，不浸泡，煎煮3次，每次1 h。结论：该提取工艺设计合理、结果可靠，可为研制风湿Ⅱ号合剂提供理论基础。

风湿Ⅱ号合剂；提取工艺；绿原酸；哈巴俄苷；正交试验

“风湿Ⅱ号”为郧阳医学院附属太和医院中西医结合科使用多年的验方，处方中主要组成为忍冬藤、玄参、全蝎、乌梢蛇、土鳖虫等13味药材。全方具有祛风止痛、活血行气、清热解毒、疏风通络之功效。临床多以煎剂给药，疗效确切，副作用小。但煎剂携带、使用不便，将其改剂型为合剂，更容易被患者接受。本研究以绿原酸与哈巴俄苷含量、浸膏得率为考察指标，采用煎煮、微波提取、超声提取3种方法，确定最佳提取方法，然后采用正交试验法优选风湿Ⅱ号合剂最佳提取工艺条件。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate3000型高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器、Chromeleon软件数据处理系统（美国戴安公司）；FA 2004型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；RE-52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；CQX25-06型超声波清洗器（功率250 W，频率25 kHz，上海必能信超声有限公司）；PJ17F-F（Q）型美的微波炉（功率700 W，顺德市美的微波炉制造有限公司）；TDL-5A型台式低速离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）；DZTW型电热套（北京市永光明医疗仪器厂）；HH系列电热恒温水浴锅；8KFG01型电热恒温鼓风干燥箱（湖北省黄石市医疗器械厂）。

1.2 试药

药材来自郧阳医学院附属太和医院中药房，经笔者鉴定符合2005年版《中国药典》[1]标准（试验前各药材分别烘干粉碎过1号筛）；绿原酸对照品（批号：110753-200413）、哈巴俄苷对照品（批号：111730-200604）均由中国药品生物制品检定所提供；水为重蒸馏水，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 指标成分的测定

2.1.1 绿原酸含量测定（1）色谱条件[1]：色谱柱为Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90），柱温为30℃，流速为1 mL·min-1，检测波长为327 nm。（2）对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.242 mg的溶液，摇匀，即得。（3）供试品溶液的制备：从定容至500 mL的提取液中精密量取20 mL，置蒸发皿中，在水浴上（70℃）蒸干，加适量甲醇超声提取30 min，过滤，滤液置25 mL容量瓶中定容，摇匀，滤过（0.45 μm），取续滤液，即得。（4）线性关系考察：精密吸取上述对照品溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，采用二倍稀释法，依次稀释5个浓度，分别取不同浓度对照品溶液各10 μL进样，按上述色谱条件测定峰面积。以绿原酸浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：Y＝451.59X＋0.8696（r＝0.9999）。结果表明，绿原酸在0.242～0.0075 mg·mL-1浓度范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。（5）精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10 μL，按上述色谱条件测定6次。结果，RSD＝0.98%（n＝6），表明仪器精密度良好。（6）稳定性试验：将供试品溶液于室温下放置，分别在0、2、4、6、8、10 h时各取10 μL，按上述色谱条件测定。结果，RSD＝1.57%（n＝6），表明供试品溶液在10 h内稳定。（7）加样回收率试验：精密吸取已知绿原酸浓度的同一提取液6份各20.0 mL，分别精密加入绿原酸对照品溶液（0.242 mg·mL-1）2.0 mL，按“2.1.1（3）”项下方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件进样测定。结果，平均加样回收率为98.35%，RSD＝2.04%（n＝6）。（8）含量测定：精密吸取供试品溶液10 μL，注入色谱仪中，按上述色谱条件测定，计算绿原酸含量。

2.1.2 哈巴俄苷含量测定（1）色谱条件[1]：色谱柱为Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-1%醋酸溶液（B）（梯度洗脱：0～20 min，流动相A从20%→50%；流动相B从80%→50%），柱温为30℃，流速为1 mL·min-1，检测波长为278 nm。（2）对照品溶液的制备：精密称取哈巴俄苷对照品适量，加30%甲醇制成每1 mL含0.108 mg的溶液，摇匀，即得。（3）供试品溶液的制备：按“2.1.1（3）”项下方法制备。（4）线性关系考察：精密量取上述对照品溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，采用二倍稀释法，依次稀释5个浓度，分别取不同浓度对照品溶液各10 μL进样，按上述色谱条件测定峰面积。以哈巴俄苷浓度（X）为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程：Y＝396.39X+ 0.0568（r＝0.9999）。结果表明，哈巴俄苷在0.1080～0.0034 mg·mL-1浓度范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。（5）精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10 μL，按上述色谱条件测定6次。结果，RSD＝1.07%（n＝6），表明仪器精密度良好。（6）稳定性试验：将供试品溶液于室温下放置，分别在0、2、4、6、8、10 h时各取10 μL，按上述色谱条件测定。结果，RSD＝1.41%（n＝6），表明供试品溶液在10 h内稳定。（7）加样回收率试验：精密吸取已知哈巴俄苷浓度的同一提取液6份各20.0 mL，分别精密加入哈巴俄苷对照品溶液（0.1080 mg·mL-1）1.0 mL，按“2.1.1（3）”项下方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件进样测定。结果，平均加样回收率为98.86%，RSD＝1.84%（n＝6）。（8）含量测定：精密吸取供试品溶液10 μL，注入色谱仪中，按上述色谱条件测定，计算哈巴俄苷含量。

2.1.3 浸膏得率的测定从定容至500 mL的提取液中分别精密量取20 mL，置于干燥至恒重的蒸发皿中，水浴上蒸干后在烘箱中（105℃）干燥至恒重，稍冷后于干燥器内冷却0.5 h，取出，精密称重，计算浸膏得率。

2.2 不同提取方法比较

2.2.1 处方忍冬藤30 g、玄参20 g、全蝎5 g、乌梢蛇10 g、土鳖虫10 g等13味药材。

2.2.2 提取方法（1）煎煮法：称取处方量1/3药材粉末3份，分别加入12倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2 h，滤过，共煎煮3次，合并滤液，滤液浓缩至400 mL，5000 r·min-1离心15 min，取上清液定容至500 mL。（2）超声提取法：称取处方量1/3药材粉末3份，加入12倍量水，浸泡0.5 h，超声提取1 h，滤过，共提取3次，合并滤液，其余步骤同“2.2.2（1）”项。（3）微波提取法：称取处方量1/3药材粉末3份，加入12倍量水，浸泡0.5 h，置微波炉中提取（中低火）3次，每次30 min，滤过，合并3次滤液，其余步骤同“2.2.2（1）”项。（4）结果及分析：采用煎煮法、超声提取法、微波提取法对药材进行提取得到的提取液，分别按“2.1.1”、“2.1.2”和“2.1.3”项下方法测定提取液中绿原酸和哈巴俄苷含量以及浸膏得率。3种不同提取方法的比较结果见表1。由表1可知，煎煮法得到的绿原酸和哈巴俄苷含量以及浸膏得率均比超声提取法和微波提取法高，所以风湿Ⅱ号合剂的提取方法选择煎煮法。

表13 种不同提取方法的比较（n＝3）Tab 1Comparison of 3 kinds of extraction methods（n＝3）

2.3 提取工艺的优选

2.3.1 正交设计根据文献资料[2，3]，选择加水量（A）、浸泡时间（B）、煎煮时间（C）、煎煮次数（D）为考察因素，每个因素取3个水平，以绿原酸与哈巴俄苷含量、浸膏得率为考察指标，选用L9（34）正交表对这4个因素进行综合考察，以筛选煎煮法提取风湿Ⅱ号合剂的最佳工艺条件。因素水平见表2；正交试验结果见表3；方差分析结果见表4（注：综合评分值＝（绿原酸含量/最大绿原酸含量）×100×0.4+（哈巴俄苷含量/最大哈巴俄苷含量）×100×0.4+（浸膏得率/最大浸膏得率）×100×0.2[4]）。

表2 因素水平Tab 2Factors and level

表3 正交试验结果Tab 3Results of orthogonal test

由表2、表3、表4可知，各因素作用主次顺序为D＞A＞C＞B。结果表明，因素D（煎煮次数）为主要影响因素，差异有极显著性（P＜0.01）；因素A（加水量）为次要影响因素，差异有显著性（P＜0.05）；因素B、C对试验结果均无显著影响（P＞0.05）。由于B、C 2项各水平间差异无显著性，因素3水平间结果差异极小，考虑到实际生产中能源消耗、节约时间等因素，最终确定提取工艺为A3B1C1D3，即12倍加水量，不浸泡，煎煮3次，每次1 h。

2.3.2 验证试验取处方量1/3的药材3份，按照优化的条件进行工艺验证试验。结果，绿原酸含量为0.0292 mg·mL-1，哈巴俄苷含量为0.0116 mg·mL-1，浸膏得率为31.14%，平均综合评分为99.99（n＝3），RSD＝2.3%，表明正交设计筛选出的工艺稳定可行。

表4 方差分析结果Tab 4Results of variance analysis

3 讨论

风湿Ⅱ号合剂为复方制剂，原煎剂用水煎煮，为保证临床疗效，选择水为提取溶剂。根据文献资料[4，5]，动物药材全蝎以乙醇为溶剂可提取出更多的有效成分，但预试验发现动物药材乙醇提取液与其它药材水提液混合后有沉淀产生，影响合剂的质量，因此选择水作为全方的提取溶剂。

处方中忍冬藤具清热解毒、疏风通络的功效，玄参具凉血滋阴、泻火解毒的功效，分别为君药和臣药，其分别含有的化学成分绿原酸和哈巴俄苷均为有效成分之一，故以绿原酸、哈巴俄苷含量为评价指标；又因处方中其它药材味数较多，有效成分暂不十分明确，故试验还将浸膏得率作为评价指标之一。

用多指标正交试验进行工艺优选时，首先要解决指标间量纲不一致和指标间的矛盾问题。然后针对指标间的重要性差异给出各指标权重，综合评分后再进行统计分析。应用多指标综合评分法时，设置指标的权重，需根据具体情况具体分析。本试验中绿原酸、哈巴俄苷为有效成分，将其权重系数都设为0.4，而浸膏得率的大小对疗效的影响没有前两者重要，所以将其权重系数设为0.2。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：76、133.

[2]梅全喜，曾聪彦，黄伟群.复方土牛膝颗粒的水提工艺优选及质量控制方法研究[J].中国药房，2007，18（27）：2107.

[3]张涛，曾聪彦，梅全喜，等.正交试验优选四黄膏提取工艺[J].中国药房，2008，19（12）：908.

[4]李丽，周军，张莹，等.多指标综合评分法优化痛风宁颗粒提取工艺[J].中成药，2007，29（2）：281.

[5]邹龙，郭建生，桂卉，等.全蝎镇痛成分的提取工艺研究[J].湖南中医学院学报，2004，24（2）：19.

Optimization of the Extraction Technology of FengshiⅡMixture by Orthogonal Experiment

ZHU Hai-tao，CHEN Li，YUAN Sheng-hao，DU Shi-ming（Taihe Hospital of Yunyang Medical College，Shiyan 442000，China）
GUAN Qun（Dept.of Pharmacy，Yunyang Medical College，Shiyan 442000，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of FengshiⅡmixture.METHODS：Decoction，microwave extraction and ultrasonic extraction were applied.The extraction method was optimized with content of chlorogenic acid and harpagoside，the yield of extraction as index.The extraction technology was optimized by orthogonal experiment.RESULTS：Decoction is the optimal extraction method，and the optimal extraction technology was as follows：10-fold water，no marinating，extracting for 3 times and for 1 hour.CONCLUSION：The extraction technology is reasonable and reliable，which provide theory basis for the preparation of FengshiⅡmixture.

FengshiⅡmixture；Extraction technology；Chlorogenic acid；Harpagoside；Orthogonal experiment

R283；R97

A

1001-0408（2010）19-1754-03

2009-06-25

2009-11-27）