自体冷血心脏停搏液对未成熟心肌细胞三磷酸腺苷及二磷酸腺苷的影响

沈定荣,王 涛,张 青,马 超,孟保英

先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是目前我国最常见的出生缺陷和婴幼儿首位死因,早期手术是根治先心病、降低死亡率的唯一有效措施。由于婴幼儿各脏器发育不成熟,心内直视手术中的心肌保护及其术后心功能不全仍然是制约小婴儿心血管手术发展的主要因素,未成熟心肌保护始终是国内外学者研究的重点课题。

目前对未成熟心肌的定义还没有统一明确的标准。一般把未成熟哺乳动物(羚羊 6天,猪龄 15天,新西兰兔龄 4天,犬龄 8周)新生儿及婴幼儿心肌称为未成熟心肌[1]。尽管未成熟心肌与成熟心肌在形态结构、生理功能及代谢特点上存在明显差异,未成熟心肌与成熟心肌在组织、结构、能量产生和利用及兴奋收缩耦联系统方面存在明显的区别[2-4],但是许多医院在心脏手术时都采用与成年患者基本相似的心脏停搏液,可能导致婴幼儿未成熟心肌损伤。

常用的停搏液种类较多,各自特点不同,对未成熟心肌的保护效果差异显著。本研究通过观察自体冷血心脏停搏液与含血停搏液、St.Thomas液、HTK液灌注前、主动脉开放后 30min的心肌细胞三磷酸腺苷(ATP)及二磷酸腺苷(ADP)含量的变化,来评价自体冷血停搏液能否减轻缺血再灌注期未成熟心肌的损伤。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取 2007年6月到 2010年3月在我院收治的行体外循环室间隔缺损修补术的患儿80例 ,其中男 52例,女 28例 ;年龄 2.5～ 12(5.6)个月;体重 3.6～8.4(6.3)kg。随机分为自体冷血停搏液组(A组,n=20)、冷血停搏液组(B组,n=20)、St.Thomas液组(C组,n=20)和 HTK液组(D组,n=20)。术前无肝肾功能异常、肺炎等合并症,末梢血常规正常。经医院伦理委员会讨论通过,并经监护人知情同意。手术由同一组医生、麻醉师、体外循环师合作完成。

1.2 主要试剂 ATP标准品(中国药品生物制品检验所,批号 140674-200401),ADP标准品(Sigma公司,批号 048K7005)。

1.3 方法

1.3.1 心脏停搏液制备 A组:CPB开始前,经主动脉根部按血液:晶体 4：1比例快速抽取血液,K+浓度 20 mmol/L,抽血时间约 30秒,保持动脉收缩压≥30 mm Hg,停搏液制备完毕后,经主动脉插管补充血容量以维持循环稳定。B组:CPB开始后,经氧合器按血液:晶体 4：1比例配制停搏液。C组:单纯应用St.Thomas液。D组:单纯应用 HTK液。停搏液配制后浸入冰屑液中制成 4℃冷停搏液备用。

1.3.2 体外循环及心肌保护 采用 JOSTRA人工心肺机,POLYSTAN膜式氧合器,全血预充,体外循环采用浅、中低温(25～32℃),红细胞比容(Hct)0.25～0.30。并行循环降温,阻断升主动脉,灌注心脏停搏液。

1.3.3 灌注方法 升主动脉阻断后,按实验设计分别经主动脉根部灌注 4℃停搏液,剂量 30ml/kg,灌注压力 30 mm Hg。

1.3.4 心肌取材 分别在主动脉阻断前及主动脉开放后 30 min取右心耳 50 mg,迅速称量后置入液氮中,移入-80℃冰箱保存。

1.3.5 样品预处理 取出冷冻保存的心肌组织,加入 1 ml冷 0.42 mol/L HClO4溶液,制成组织匀浆后,冰浴放置 1 h,在 4℃下 14 000 r/min离心 15 min。上清液用 4.5 mol/L KOH溶液调 pH为 7,再在 4℃下 14 000 r/min离心 15m in,上清液过滤后上机分析。

1.3.6 色谱分析条件 美国 Waters 2695 HPLC,Sepax Hp-C18色谱分析柱(5μm,4.6 mm×250 mm),柱温 35℃,流动相为 50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.5),流速 1 ml/min,紫外线检测波长 254 nm,样品进样体积 20μl。所有样品上机前均过滤并再次离心。

2 结 果

2.1 临床资料 两组患儿的年龄、体重、CPB时间、主动脉阻断时间比较无统计学差异(P＞0.05),见表1。

2.2 心肌 ATP、ADP含量 各组患儿主动脉阻断前心肌 ATP与 ADP含量无统计学差异(P＞0.05);主动脉开放后 30 min均较阻断前显著减少(P＜0.01);A组患儿主动脉开放后 30min心肌 ATP与ADP含量较其他组显著增高(P＜0.01)。见表2。

表1 两组患儿临床情况(n=20,±s)

表1 两组患儿临床情况(n=20,±s)

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表2 主动脉阻断前、开放后30min心肌ATP、ADP含量的比较(μmol/mg,±s)

表2 主动脉阻断前、开放后30min心肌ATP、ADP含量的比较(μmol/mg,±s)

注:同组术后与术前比较 *P＜0.05,**P＜0.01;各组与 A组比较 #组间比,P＜0.05,##P＜0.01

A组 1.45±0.41 0.94±0.40** 3.00±0.85 1.75±0.51**B组 1.42±0.48 0.66±0.36**## 2.62±1.03 1.08±0.45**##C组 1.50±0.35 0.45±0.28**## 2.90±0.95 0.83±0.69**##D组 1.54±0.28 0.59±0.30**## 2.78±0.93 1.12±0.41**##

3 讨 论

主动脉阻断、灌注停搏液后,心肌处于缺血、停搏状态。主动脉再次开放后,随着冠状动脉再次通血、心脏复跳,产生了心肌缺血再灌注损伤,这与下列因素有关:自由基生成增多;细胞内钙超载;白细胞趋化、黏附及对组织的损伤;高能磷酸化合物缺乏;内皮素对心肌的损伤;血管紧张素Ⅱ(angiotensionⅡ)对组织的损伤。而在心肌缺血再灌注损伤过程中,激活心肌兴奋收缩耦联过程,导致肌原纤维挛缩,不但加速能量的消耗,其挛缩力可使肌纤维膜破裂。同时,Ca2+能以磷酸钙的形式沉积于线粒体,损伤线粒体功能,使 ATP产生障碍。

短时间的缺血再灌注,心肌代谢可迅速改善并恢复正常,但较长时间的缺血后再灌注反而使心肌代谢障碍更为严重,ATP和磷酸肌酸(CP)含量迅速下降,氧化磷酸化障碍,线粒体不再对 ADP反应。这是因为再灌注时自由基和钙超载等对线粒体的损伤使心肌能量合成减少;加之再灌注血流的冲洗,ADP、AMP等物质含量比缺血期降低,造成合成高能磷酸化合物的底物不足。本研究中也观察到,各组患儿主动脉开放后心肌 ATP、ADP均降低,这与线粒体损伤、合成能量物质能力下降,以及能量物质底物减少有关。这说明了无论使用何种停搏液,均无法避免缺血-再灌注损伤。

本研究中,开放后 30min HTK液组心肌 ATP及ADP含量明显高于 St.Thomas液组,提示 HTK液对所灌注的未成熟心肌能量物质保护作用优于后者。HTK液被公认为心肌保护效果最好的晶体停搏液,含有组氨酸/组氨酸盐缓冲系统是其显著特点。与其他缓冲系统相比,组氨酸对人体有较好的水溶性和分解能力,能较好地由毛细血管渗透到组织间隙而发挥作用。HTK液中含有的 α-酮戊二酸与色氨酸通过代谢均可生成 ATP,为缺血再灌注器官提供能量;同时,色氨酸作为膜稳定剂,可防止组氨酸进入细胞内。另外,HTK液含有甘露醇,作为羟自由基的清除剂,可防止氧自由基的损伤。

同样,开放后 30min含血停搏液组心肌 ATP及ADP含量明显高于 St.Thomas液组,提示含血停搏液对所灌注的未成熟心肌能量物质保护作用优于后者。与晶体停搏液相比,含血停搏液携带氧、可减少心脏停搏时冠状动脉缺血缺氧。另外,它含有丰富的蛋白,具有稳定的胶体渗透压,可防止血管内水分外渗。Illes等[5]通过含血停搏液和晶体停搏液的比较,发现前者的优点不仅是向心肌提供氧,它还有更多的保护功能,如电解质的缓冲作用,蛋白质缓冲作用,自由基清除作用。有学者认为,含血停搏液在低温灌注时,红细胞在毛细血管内聚集,灌注阻力增高。但龙村等[6]从光镜中未发现上述情况;电镜发现含血停搏液灌注更有利于心肌细胞超微结构的保护。

开放后 30 min自体冷血停搏液组心肌 ATP及ADP含量明显高于其他各组,提示灌注自体冷血停搏液可使未成熟心肌更有效地保存能量物质。由于普通含血停搏液血液成分来源于体外循环管路,当心肺转流后,血液与管道接触,补体活化,激活大量中性粒细胞(PMN),再灌注过程中产生氧自由基,引起白细胞浸润[7],使人体产生广泛的炎性反应,导致无复流现象[8]。PMN可通过产生氧自由基或释放蛋白水解酶直接激活补体。激活后的补体降解产物又是 PMN的趋化和活化刺激剂。同时补体 C3bi可使覆盖在细胞上的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)得到表达。ICAM-1表达后使 C3bi、内皮细胞、ICAM-1三者更牢固结合,更有助于 PMN从微循环渗出并聚集在心肌组织中,促进炎性介质释放,诱导黏附分子表达,增加了血管腔的阻力,加重心肌再灌注损伤。

自体冷血停搏液直接取自主动脉根部的动脉血,因此避免上述反应过程。在抽取主动脉根部血液过程中,主动脉收缩压降至 30 mm Hg,持续时间约 30秒。停搏液配制完毕,由体外循环灌入等量血液,使血压恢复至配停搏液前水平,再开始并行循环。因此,在心脏停搏前,出现短时间的全身器官灌注不足,即缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC)。国内外许多学者认为 IPC对心肌的保护是迄今发现最强的内源性保护,其确切机制尚不清楚。近来研究表明短暂缺血-再灌注产生的氧自由基、腺苷、一氧化氮、缓激肽和去甲肾上腺素等物质,与其相应受体结合激活酪氨酸激酶与蛋白激酶 C(PKC),引起靶蛋白磷酸化及 ATP敏感钾通道(KATP)的开放以达到保护效果[9-10]。延迟性保护机制涉及基因转录、蛋白质的合成等,保护性蛋白,如超氧化物歧化酶(SOD)、热休克蛋白(HSP)的表达可能是参与该保护性机制的重要环节[11]。

综上所述,缺血再灌注损伤是体外循环下心内直视手术心肌损伤的重要因素。手术中虽不能完全避免,但使用合适的停搏液以及恰当的灌注方法可以减轻其带来的伤害。灌注自体冷血停搏液可使未成熟心肌更有效地保存能量物质,而足够的能量物质也是复跳后的心肌细胞维持正常功能的前提条件。这也进一步为我们提示了自体冷血停搏液可能具有良好的心肌保护效果,值得进一步研究及推广。

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