缺血再灌注前后人心肌组织中Notch信号通路相关分子的变化

杨 阳,金振晓,段维勋,毕生辉,杨建宝,卢佳佳,易定华

Notch信号是一条进化中高度保守的反映细胞间通讯机制的通路,它对于许多器官发育过程中细胞命运的决定起着重要的作用,经典的例子包括果蝇外周神经系统的发生、线虫的外阴发育和哺乳动物的淋巴系统发育[1-2]。有动物实验研究提示Notch信号途径在成体心肌损伤保护中发挥作用[3]。本研究中,我们将检测体外循环心脏手术过程中,心肌组织中 Notch信号途径相关受体 Notch1胞内区(NICD)和下游分子 Hes1的表达变化,寻找Notch信号途径在人心肌缺血再灌注损伤中发挥作用的直接证据。

1 材料和方法

1.1 研究对象 2010年3月,20例在第四军医大学西京医院心血管外科接受体外循环心脏手术的患者纳入本研究,所有患者术前未合并其它系统性疾病,术前 2周内未服用激素类药物。其中男 10例,女 10例;年龄 3～64(26.5+19.2)岁,包括法洛四联症 4例,右室双出口 3例,室间隔缺损 6例,房间隔缺损 1例,二尖瓣、主动脉瓣双瓣置换 3例,主动脉瓣置换 1例,二尖瓣置换 2例。

1.2 右心房心肌组织获取方法 所有患者采用芬太尼和七氟烷复合麻醉,手术均经胸骨正中径路,常规建立体外循环,中度血液稀释(Hct 0.20～0.25),中度低温 28～32℃,升主动脉阻闭后,间断顺行灌注冷血停搏液维持术中心脏停搏,平均体外循环时间(80.9±32.5)min,平均主动脉阻断时间(42.6±25.2)min。体外循环开始前及心脏复跳后15min从右房切开位置获取右心房心肌样本,并立即放入不含核糖核酸酶的塑料容器内,液氮储存,待检测。

1.3 实验试剂及主要仪器 β-actin兔抗人多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司,北京),兔抗人 Notch1单克隆抗体(Abcom公司,美国),兔抗人 Hes1抗体(Santa Cruz公司,美国),辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司,北京),BCA-100蛋白质定量测定试剂盒(Pierce公司,美国),组织裂解蛋白提取液(碧云天生物技术研究所,上海),蛋白酶抑制剂(Sigma公司,美国),预染标准蛋白质 Marker(Fermentas公司,美国);电泳及湿转转移槽(Bio-Rad公司,美国),Western发光照相系统(UVP公司,美国)。

1.4 Western blotting分析方法 将留取的心肌组织在裂解缓冲液中进行研磨裂解 30min。12 000 r/min离心 15 min收集组织裂解物,蛋白浓度用 BCA法进行测定。20μg总蛋白在 1×SDS缓冲液中煮 7 min,10%SDS-PAGE电泳,通过电转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用含 5%脱脂奶粉的TBS-T于室温封闭 1 h,然后分别加 Notch1、Hes1和 β-actin抗体于含 1%脱脂奶粉的 TBS-T进行稀释,接着加连接辣根过氧化物酶的二抗,用 ECL发光液进行曝光显影,最后用 UVP照相系统进行照相和并用其附带软件蛋白进行相对表达量分析。

1.5 统计分析方法 采用统计软件 SPSS 12.0进行统计分析,所有数据±标准差(±s)表示,计量资料采用配对 t检验,P＜0.05有显著性差异。

2 结 果

Western blotting检测 NICD和 Hes1基因的表达缺血再灌注后 20例患者心肌 NICD表达明显减弱,缺血再灌注前后 NICD的 western blotting信号强度与 β-actin信号强度比值分别为:(4.28±0.45)和(1.55±0.36),P＜0.01,见图1;缺血再灌注后19例患者心肌 Hes1表达减弱,1例患者 Hes1表达升高,但全组患者 Hes1表达显著下降,Hes1信号强度与 β-actin信号强度比值分别为:(4.61±0.52)和(1.31±0.32),P＜0.01,见图2。

图1 缺血再灌注前后人心房肌组织中 NICD的表达

图2 缺血再灌注前后人心房肌组织中 Hes1的表达

3 讨 论

目前对抗缺血再灌注方法主要有内源性(如缺血预处理等)和外源性(如药物预处理等)两种,这些方法都被证明是确实有效的。但是由于临床患者特殊性(如安全性、伦理),这些心肌保护方法难以很好的在临床应用,因此众多学者通过研究缺血再灌注的具体机制,尝试找到心肌保护信号通路中的关键靶点并研究出作用靶点的方法,从而达到不影响患者健康的情况下保护心肌的目的。

研究证明,Notch信号通路在心血管系统的发生、发育、病理和生理过程中发挥重要作用[4]。Gude等[3]的研究提示 Notch信号通路可能在心肌缺血损伤及心肌保护中发挥调控作用。Notch信号通路和 PI3K/Akt、NF-κB等信号通路通过复杂的分子网络互相影响[5-7],而 PI3K/Akt、NF-κB等信号通路是心肌缺血再灌注过程中已知的具有保护作用的重要效应因子[8-11],这提示 Notch信号通路可能通过这种多信号通路级联效应调控心肌缺血再灌注过程,但 Notch信号通路在人心肌缺血再灌注过程中的变化尚无相关研究。本实验通过检测 Notch信号途径相关受体 Notch1胞内区(NICD)和下游分子 Hes1在围体外循环期的表达变化,发现人心肌组织缺血再灌注过程中 Notch途径相关受体Notch1胞内区和下游分子 Hes1表达均显著下降,提示 Notch信号途径可能在人心肌缺血再灌注损伤中发挥调控作用。一般意义的心肌保护多指心室肌,特别是左心室心肌的保护,心房肌对缺血的耐受性和缺血后的反应与心室肌有很大的差异,该研究限于条件选用心房肌标本,因此结果的代表性和临床意义就受到局限,下一步我们将先在动物实验中重复相关检测,进一步验证我们的结论。

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