丹参酮ⅡA对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

江苏省大丰市人民医院（224100）严如华

南京中医药大学（210029）范乃兵

脑卒中因其发病率、致残率和致死率高而严重危害人类的健康，在临床初次脑卒中病例中，大脑中动脉阻塞占了很大比例[1]。本实验采用缺血3h，再灌24h建立大脑中动脉阻断再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion）模型，使其病理生理过程充分模拟临床脑卒中病例，以此来观察丹参酮ⅡA（tanshinone ⅡA,TSNⅡA）对脑缺血再灌注大鼠的保护作用。

1 实验材料

1.1 药物及试剂 丹参酮ⅡA，西安冠宇生物技术有限公司提供。尼莫地平注射液，德国拜耳公司产品，批号bxnl3p1。水合氯醛，AR，250g / 瓶，上海青析化工科技有限公司，批号：20050107。氯化三苯基四氮唑（TTC），中国医药（集团）上海化学试剂公司产品，批号：20040328。TT、PT、APTT试剂盒，德国美创公司生产，批号：354201。磷酸氢二钠，AR，上海实意化学试剂有限公司生产，批号：20031116。磷酸二氢钾，AR， 南京化学试剂厂，批号：030908。柠檬酸三钠，AR，上海凌峰化学试剂有限公司，批号：030413。5’-腺苷二磷酸二钠盐，上海伯奥生物科技有限公司（进口分装），批号：990527。磷酸缓冲液：精密称取磷酸二氢钾3.629g，置100ml双蒸水中，不断搅拌，待完全溶解后再加双蒸水至400ml，配成1/15M的溶液；再精密称取磷酸氢二钠38.204g，置于200ml双蒸水中，不断搅拌，待完全溶解后再加入双蒸水至1600ml，配成1/15M的溶液；二者按照体积2：8合并，备用。TTC染色液：精密称取红四氮唑1g，置于80ml磷酸缓冲液中，不断搅拌，待完全溶解后再加磷酸缓冲液至100ml，配成1%的TTC磷酸缓冲液备用。应注意TTC染色液现配现用，并注意避光。

1.2 仪器 KD-500Z柯尼卡数码相机（500万象素），普立华科技有限公司；BS110S电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；DHG-9053A型电热恒温干燥箱，上海医用恒温设备厂；STEELIEX R80型锥板式黏度计，北京世帝科学仪器公司；STEELIEX血小板聚集凝血因子分析仪，北京世帝科学仪器公司；LDZ5-2离心机，北京医用离心机厂；电热恒温水箱，北京东霞开科学仪器厂；GC-1200放射免疫计数器，科大创新股份公司中佳分公司。

1.3 尼龙栓子的制备 参照文献方法，将一长50mm、直径0.235mm的尼龙线的一端加热熔成光滑的球形，并在距球端18mm处标记，酒精擦拭后备用。

1.4 实验动物 清洁级SD大鼠，全雄性，体重250g～350g，由上海斯莱克动物有限公司提供，实验动物生产许可证：SCXK（沪）2003-0003；实验动物使用许可证：SYXK（苏）2002-0053。

2 实验方法与观察指标

2.1 动物分组及给药 大鼠随机分为6组，即假手术组、模型对照组、尼莫平组（2mg/kg）和丹参酮ⅡA低剂量组（7.5mg/kg）、中剂量组（15mg/g）、高剂量组（30 mg/kg），灌胃给药，每日1次，连续7d，末次给药后1h，按文献[2]方法制备脑缺血再灌注模型，尼莫地平组于手术前尾静脉注射，而假手术组和模型对照组给予等体积的生理盐水。

2.2 实验方法 采用颈内动脉栓线法制作右侧大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型。采用Longa的方法加以改进，以10%水合氯醛麻醉（350mg/kg，ip），仰位固定于手术台上，颈部正中切口，切开皮肤后，钝性分离牵开颈部肌肉，分离出颈总动脉（CCA），继续向下分离并结扎颈外动脉（ECA）及颈外动脉各分支（枕动脉、甲状腺上动脉、舌动脉和面动脉），轻轻剥离迷走神经，分离出颈内动脉（ICA）和翼腭动脉，ECA近心端备线，用动脉夹夹闭ICA和CCA，在ECA距ICA2mm处剪一小口，将一尼龙栓子插入ECA 并进入CCA，轻扎备线，防止出血，剪断ECA，松开ICA的动脉夹，牵引ECA，使其和ICA约成一直线，轻轻回抽尼龙线，使其顺入ICA，继续向下推进（注意避免尼龙线进入翼腭动脉），直至有轻微阻力。此时可见ICA 伸展，尼龙线插入深度约为18mm，表明尼龙线已经穿过大脑中动脉（MCA）起始段，到达大脑前动脉（ACA）近端，阻断了MCA的所有血供来源，包括来自ICA 和ACA及大脑后动脉的血液供应。松开CCA动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤，回笼饲养。缺血3h后再灌注，再灌注时轻拉尼龙线，使尼龙线拔出颅外，血流再通，修剪尼龙线，缝合皮肤，回笼自然喂养。以上过程均在室温恒定（24～25℃）情况下进行，以利于评价脑缺血情况。

2.3 观察指标和检测指标

2.3.1神经行为学评分 待造模大鼠清醒后，观察大鼠的行为活动情况。在MCAO后3h及24h，参考Bederson[3]等的方法对术后动物的行为缺陷进行分级评分，分级标准如下：

2.3.2 TTC染色测量脑梗塞面积 TTC染色测量脑梗塞面积[4]：MCAO后24小时，断头取脑，将脑置冰冷的生理盐水中（2～3℃）10min，去除嗅球、小脑和低位脑干后，用生理盐水冲洗大脑使表面不留血污，吸干周围水分后，沿冠状切四刀，切成五片。第一刀在脑前极与视交叉连线中间；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。然后迅速将脑片置5ml含有1%TTC的磷酸缓冲溶液中，避光温孵30分钟，其中每隔7～8分钟翻动一次，经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而梗塞组织呈白色，且界限分明。温孵完毕后将脑片照相，剪下红白颜色区称重计算。然后根据重量求面积法，分别计算出5个脑片共10个平面的总面积和梗塞区域的面积，求出梗塞区面积占半球总面积的百分比，即梗塞率。

2.3.3 脑含水量和脑指数的测定 大脑中动脉阻断24h后的大鼠，断头处死后，取出大脑，称脑湿重后将脑组织置于115℃电热干燥箱中烘至恒重，称取干重，按下列公式计算脑含水量及脑指数：脑含水量（%）＝湿重－干重/湿重×100% ，脑指数＝湿重×100/体重

2.3.4 血小板聚集功能的测定[5]MCAO 24h的大鼠，颈总动脉插管放血，用3.8%的枸橼酸钠抗凝，以800r/min离心10min，取富血小板血浆（PRP），剩余部分以3000r/min离心10min，即为贫血小板血浆（PPP），每次取250μl PRP，加入诱导剂ADP溶液10μl（诱导剂终浓度：5.6μg/L），按比浊法在血小板聚集凝血因子分析仪上测定血小板聚集率。记录最大聚集率并按下列公式计算抑制率聚集抑制率。聚集抑制率(%)= 模型组最大聚集率-给药组最大聚集率/模型组最大聚集率×100%

大鼠行为缺陷评分标准

附表1 TSNⅡA对缺血再灌注大鼠行为学评分及脑梗塞率的影响（±SD ）

附表1 TSNⅡA对缺血再灌注大鼠行为学评分及脑梗塞率的影响（±SD ）

注：与模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

组别 剂 量(mg / kg)动物数(n) 行为学评分 脑梗塞率(%)3h 24h假手术－10 0 0 0模型对照－10 2.90±0.61 2.80±0.58 20.15±7.18尼莫地平 2 10 1.89±0.72** 1.81±0.63** 11.43±6.53**TSNⅡA高 30 10 1.97±0.69** 1.92±0.48** 12.65±6.73**TSNⅡA中 15 10 2.31±0.51** 2.06±0.82** 13.42±7.35*TSNⅡA低 7.5 10 2.67±0.61 2.17±0.54* 17.38±6.45

附表2 TSNⅡA对缺血再灌注大鼠脑含水量和脑指数的影响（±sD）

附表2 TSNⅡA对缺血再灌注大鼠脑含水量和脑指数的影响（±sD）

注：与模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

脑指数(g / 100g)假手术－10 77.98±0.81** 0.445±0.029**模型对照－10 82.13±0.92 0.513±0.027尼莫地平 2 10 78.95±0.73** 0.469±0.017*TSNⅡA高 30 10 79.87±0.91** 0.482±0.017**TSNⅡA中 15 10 80.67±0.88* 0.475±0.041 TSNⅡA低 7.5 10 81.17±0.92 0.489±0.032组别 剂 量(mg / kg)动物数(n)脑含水量（%）

附表3 TSNⅡA对脑缺血再灌注大鼠血小板聚集率的影响（±sD）

附表3 TSNⅡA对脑缺血再灌注大鼠血小板聚集率的影响（±sD）

注：与模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

组别 剂 量(mg / kg)例数(n) 血小板聚集率 抑制率(%)1min 5min max假手术－10 15.98±7.13 8.92±6.37** 26.31±13.16*模型对照－10 22.68±6.32 26.38±15.24 38.54±13.18尼莫地平 2 10 15.18±6.27* 10.17±7.54** 25.23±10.92* 37.14 TSNⅡA高 30 10 16.36±5.47* 14.09±10.87 25.78±9.43* 32.71 TSNⅡA中 15 10 17.43±7.13 12.02±10.23* 25.89±8.65* 32.42 TSNⅡA低 7.5 10 18.65±7.41 12.65±10.59* 26.61±13.56* 30.86

附表4 TSNⅡA对脑缺血再灌注大鼠血液流变性的影响

附表5 TSNⅡA对脑缺血再灌注大鼠血浆中血栓素前列环素内皮素的影响（±sD）

附表5 TSNⅡA对脑缺血再灌注大鼠血浆中血栓素前列环素内皮素的影响（±sD）

注：与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

内皮素(ET)假手术－10 412.46±111.03** 650.49±136.17** 148.26±31.73模型对照－10 647.49±172.81 438.31±140.50 165.31±28.55尼莫地平 2 10 417.38±158.08** 585.55±152.43* 152.95±22.20 TSNⅡA高 30 10 433.54±144.71* 611.93±194.08* 144.74±26.50 TSNⅡA中 15 10 450.53±143.89* 579.87±217.21* 154.79±25.00 TSNⅡA低 7.5 10 513.00±121.93 526.09±165.11 157.62±21.68组别 剂 量(mg / kg)动物数(n)血栓素(TXB2)6-酮-前列腺素(6-K-PGF1a)

2.3.5 血液流变性的测定 MCAO24h后的大鼠，颈总动脉插管放血，用3.8%的枸橼酸钠抗凝，检测其血液流变性。①全血黏度：采用R－80型锥板式黏度计测定。将3.8%的枸橼酸钠抗凝的全血血样0.8ml均匀注入测试杯中，盖好定心罩，预温、测试、记录数据。②血沉和红细胞压积：取3.8%的枸橼酸钠抗凝的全血血样1ml加于压积管中观察血沉（1h），然后将压积管于3000r/min离心30分钟，测定红细胞压积。③血浆黏度：全血测试完毕后，剩余血样3000r/min离心10min，进行血浆黏度的测试。血浆黏度的测试步骤同全血，只是在菜单中用鼠标选择血浆粘度项即可，记录数据。

2.3.6 血栓素（TXB2）、前列环素（6-K-PGF1a）、内皮素（ET）含量测定 MCAO 24h的大鼠，颈总动脉插管放血，用消炎痛－EDTA.Na2和抑肽酶（25000u/ml）混合抗凝液（比例4：1）0.1ml按1：15抗凝，3000r/min离心10min，取出血浆放置于－20℃冰箱保存，备齐后送至医院放射免疫中心分别测定血栓素（TXB2）、前列环素（6-K-PGF1a）、内皮素（ET）的含量。

3 结果

3.1 神经行为学评分 3h和24h时，除假手术组外，其余各组实验动物均出现了不同程度的神经功能障碍。3h时，丹参酮ⅡA 30mg/kg、15mg/kg组动物的行为学得分均低于模型组，经统计学处理，呈显著性差异（P＜0.05）。24h后，丹参酮ⅡA各剂量组动物的行为学得分均呈下降趋势，且显著低于模型组，经统计学处理，呈显著性差异（P＜0.05），见附表1，提示丹参酮ⅡA可以改善实验动物的行为学障碍。

3.2 对脑梗塞率的影响 假手术组动物大脑无梗塞，模型组大鼠大脑有明显的梗塞（TTC染色的脑片上出现白斑），丹参酮ⅡA 30mg/kg、15mg/kg、7.5mg/kg组动物的大脑也有不同程度的梗塞，其脑梗塞率分别为12.65%、13.42%和17.38%，均低于模型组，经统计学处理，呈显著性差异（P＜0.05)。见附表1。提示丹参酮可以明显降低试验动物的脑梗塞程度。

3.3 对脑含水量的影响 模型组动物的脑含水量显著高于假手术组，表明手术可以导致脑水肿。同时丹参酮ⅡA 30mg/kg、15mg/kg、7.5mg/kg组动物的脑含水量均低于模型组，经统计学处理，呈显著性差异（P＜0.05 ，P＜0.01）。见附表2。提示丹参酮ⅡA可以降低脑缺血再灌注后的脑含水量和脑指数，减轻脑水肿。

3.4 对脑缺血再灌注大鼠血小板聚集率的影响 结果显示：丹参酮ⅡA各组动物的血小板最大聚集率均明显低于模型组，经统计学处理，呈显著性差异（P＜0.05）。结果见附表3。提示丹参酮ⅡA能够抑制脑缺血再灌注大鼠的血小板聚集。

3.5 对脑缺血再灌注大鼠血液流变性的影响 丹参酮ⅡA 30mg/kg、15mg/kg、7.5mg/kg组能有效的抑制切速200s-1、1s-1下的全血黏度、血浆黏度，经统计学处理，呈显著性差异（P＜0.05、P＜0.01），见附表4；说明丹参酮ⅡA能降低实验动物的全血和血浆黏度，可以改善实验动物的血液流变性。但对血沉和红细胞压积，各给药组均影响不大，见附表4。

3.6 对脑缺血再灌注大鼠血浆中TXB2、6-K-PGF1a、ET的影响 结果表明,模型组大鼠TXB2含量明显高于假手术组, 6-K-PGF1a含量明显低于假手术组,与假手术组比较均有显著性差异（P<0.01）；丹参酮ⅡA 30mg/kg、15mg/kg组的动物血浆中6-K-PGF1a含量明显升高,与模型组比较差异显著（P<0.05）, 而TXB2的含量明显低于模型组，差异有显著性；丹参酮ⅡA各给药组对内皮素（ET）的含量影响不大，与模型组比较，无统计学意义。见附表5。

4 讨论

建立一种接近临床状况且重复性好的动物模型对有效评价药物对缺血性脑血管病的防治效果非常必要。减轻脑细胞损伤、缩小脑梗塞范围、降低脑水肿程度和改善运动功能障碍是治疗脑梗塞的最终目的，亦可以作为评价药效的直接指标。笔者采用线栓法制备脑缺血再灌注模型，观察丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注大鼠是否具有保护作用。结果表明，丹参酮ⅡA可以显著缩小脑缺血再灌注大鼠的脑梗塞面积，减轻脑水肿，对局灶性脑缺血再灌注大鼠具有明显的保护作用。至于丹参酮ⅡA对局灶性脑缺血再灌注保护作用机理，还可通过其对粘附分子、白介素等炎症介质的影响及对神经细胞调亡等方面作进一步研究。

血液流变学改变是脑梗塞发生发展的重要因素，缓解和改善脑梗塞病人的血液流变学特性可减轻脑梗塞造成的机体损伤，还可预防脑梗塞的发生发展。丹参酮ⅡA可以显著降低大鼠血液黏度，改善血液流变性，这些药理作用对脑梗塞康复非常有用。至于丹参酮ⅡA是通过何种途径改变血液流变性，还有待于进一步研究。

综上所述，丹参酮ⅡA可明显改善大脑中动脉闭塞所致局灶性脑缺血再灌注大鼠的神经学症状，明显缩小脑梗塞范围，减轻脑水肿程度；该药还可以改善试验动物的凝血功能、血液流变性，降低血小板聚集率。因此, 丹参酮ⅡA对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有良好的保护作用，其作用途径和详尽机制有待进一步研究。