羟基脲对体外Hela细胞周期同步化作用的研究

王 昱,卢仲毅,许 峰,朱宇迪,朱宇熹

(1.第三军医大学西南医院儿科,重庆400038;重庆医科大学:2.儿童医院急诊科;3.儿童医院药剂科 400014;4.附属第一医院肿瘤科 400016;5.Department of Radiation Oncology&Ⅰmage-applied,Therapy Kyoto University Graduate School of Medicine,Japan)

羟基脲对体外Hela细胞周期同步化作用的研究

王 昱1,2,卢仲毅2,许 峰2,朱宇迪3,朱宇熹4,5△

(1.第三军医大学西南医院儿科,重庆400038;重庆医科大学:2.儿童医院急诊科;3.儿童医院药剂科 400014;4.附属第一医院肿瘤科 400016;5.Department of Radiation Oncology&Ⅰmage-applied,Therapy Kyoto University Graduate School of Medicine,Japan)

目的 探讨利用羟基脲(HU)对 Hela细胞进行细胞周期同步化。方法 培养 Hela细胞,采用 Hu处理 Hela细胞24 h,然后除去 HU,让 Hela细胞进入细胞周期 G1、S、G2/M期,通过流式细胞术确认。结果 流式细胞仪检测证实 Hela细胞在HU祛除后3.5 h处于S期,8.5 h处于 G2/M期,18 h处于 G1期。结论 HU处理可以有效地将 Hela细胞同步化于特定的细胞周期,而且方法简单,易于操作。

羟基脲;Hela细胞;细胞周期;同步化

细胞增殖分裂是细胞基本的生理活动,细胞周期的紊乱导致许多疾病[1],各种调控因子通过作用于细胞周期而产生作用[2]。肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一,从细胞周期的角度出发,探讨不同细胞周期肿瘤细胞在侵袭和转移过程中的细胞生物学特性的变化,可为肿瘤的治疗提供定量的参考依据[1]。在体外细胞水平的研究中,将细胞同步化于特定的细胞周期,可以为各种细胞因子、药物、放射的实验提供理想的实验对象[3]。为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡,常需采取一些方法使细胞处于细胞周期的同一时相,即细胞同步化技术[4-5]。采用羟基脲(hydroxyurea,HU)这种DNA合成抑制剂可逆地抑制S期细胞DNA合成而不影响其他细胞周期运转,最终可将细胞群体阻断在 G1/S期交界处[6-7],然后将含 HU的培养基置换出来,释放细胞后继续培养,按照Hela细胞的细胞周期分布在不同的时间段设计时程作流式细胞术检测,以判断细胞所处的周期。作者经过反复实验建立了Hela细胞同步化的方法。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与试剂 Hela细胞株(HeLa human cervical epithelial adenocarcinoma cell line)购自 the American Type Culture Collection。于RPMI1640培养基(Promega含10%的热灭活小牛血清、100 u/mL青霉素及100 u/mL链霉素)、37℃、5%CO2的培养箱内培养传代。

1.2 根据 Hela细胞的细胞周期设计检测细胞周期的时程Hela细胞的细胞周期分布是 S期9 h,G1期8 h,G2/M 4 h。Hu处理后的细胞处于 G1、S期的交界处,故设计时程为:HU释放后立即以及 3.5、8.5、10、11.5、14、16、18、20、22、24 h。

1.3 细胞同步化方法

1.3.1 一次阻断后释放法 采取 HU处理24 h,阻断后释放的方法。其简要步骤如下:培养 Hela细胞至对数生长期、传代、接种入6孔培养盘,浓度为5×104/mL,加入 HU至其终浓度为1 mmol/L,在上述条件下培养24 h。弃去培养液,以PBS液清洗细胞后加入新鲜培养液,然后继续培养至各个时间点。

1.3.2 两次阻断后释放法 接种 Hela细胞入6孔培养盘,浓度为5×104/mL,采取 HU终浓度为1 mmol/L处理24 h,弃去培养液,以PBS液清洗细胞后加入新鲜培养基培养10 h,然后再用 HU处理14 h,然后释放 Hela细胞。把未用 HU处理的样本作为对照。

1.4 同步率检测

1.4.1 收集细胞 达到时间点后,弃上清液,1×PBS+EDTA清洗,0.02%EDTA、25%胰蛋白酶消化收集,PBS液冲洗,以70%乙醇固定,置4℃冰箱保存备用。

1.4.2 流式细胞仪检测 流式细胞术PI染色技术,流式细胞仪(BD Bioscience)检测各时相中细胞的比例,每次分析1×104个细胞,应用 Cell Quest software(BD Bioscience)分析软件分析。

2 结 果

分别采用一次阻断和两次阻断法阻断后,测定立即以及3.5、8.5 h的结果。结果显示两次阻断法相对于一次阻断法步骤较复杂,处理的时间太长,使细胞容易过度生长。就FACS的结果来说 HU一次阻断法后细胞周期的阻断效果好,因此就采用一次阻断法继续研究。一次阻断法后8.5、10、11.5 h 3个时间点的细胞周期分布见图1。两次阻断法后18、20、22 h 3个时间点的细胞周期分布。18 h时间点,细胞主要在 G1期(图2)。综合各个时间点的流式细胞仪分析,3.5、8.5、18 h 3个时间点,细胞主要在S期、G2/M期和 G1期(图3)。

图1 HU一次阻断法+8.5、10、11.5 h

图2 HU一次阻断法+18、20、22 h

图3 HU处理同步 Hela细胞于 G1、S、G2/M期

3 讨 论

细胞的增殖分裂受生长因子、激素及癌基因产物影响,从而影响细胞周期的运行。当调控因子造成细胞周期的快速运行,将导致良性或恶性的增生;而细胞周期停滞不前则导致细胞衰老、凋亡。因此,观察各种调控因子对细胞周期运转的影响和从细胞周期的角度来观察调控运转对细胞的增殖、分裂、凋亡等行为的影响非常重要。体外培养细胞同步化法是重要的研究细胞周期的方法,其基本原理是使细胞停止在细胞周期的某一时相,目前已广泛应用于细胞动力学、人类高分辨染色体、成熟前积聚染色体以及细胞不同时相对药物敏感性等方面的研究。哺乳动物细胞和人体细胞的同步化方法,包括温度休克、照射、胰酶消化、药物抑制、机械振动收集分裂细胞等,且常常需要几种方法联合应用,以同步细胞到特定的细胞周期。

细胞周期特异性的抗癌药物抑制细胞周期的机制是特异性阻断细胞周期的特定阶段,例如阻断S期的 HU、甲氨蝶呤等;阻断M期的有紫杉醇、秋水仙素等。HU是尿素的羟基化产物,相对分子质量为76 u,是用于临床的核糖核苷酸还原酶抑制剂类抗肿瘤药物,可以阻止核苷酸还原为脱氧核苷酸,因而选择性地抑制DNA的合成,并能直接损伤DNA。因本品作用于S期,并能使部分细胞阻滞在 G1/S期的边缘,故可用作使肿瘤细胞部分同步化或放射增敏的药物[8]。本研究采用HU阻断 Hela细胞的细胞周期,然后释放,Hela细胞就随着释放后的时程,进入各个细胞周期,经过多次重复的实验,细胞的同步率均能稳定,细胞的同步水平几乎不会改变,表明这一同步化法能够满足实验条件的要求。

HU作为临床上治疗慢粒、真性红细胞增多症的主要用药之一[9],对头颈部原发性鳞癌、复发性转移性卵巢癌等亦有一定疗效[10],还可作为放射增敏剂增加放疗对头颈部肿瘤的疗效[11-12]。目前在临床上,放、化疗的时程安排仍然是有待解决的问题。放疗对 G2/M期细胞敏感,对S期细胞不敏感,如果时程安排不当,可能造成放、化疗的作用相拮抗[13-14],从而降低治疗肿瘤的疗效。如何才能达到最佳的协同效果,合理安排放、化疗的时程非常重要[15]。将 HU作用于肿瘤细胞(Hela细胞)24 h,然后系统地用流式细胞仪观察其对 Hela细胞周期的影响,对于安排放、化疗时程能够起到参考作用。本课题下一步将就HU同步化动物在体实验进行研究,以期为临床治疗提供更有价值的依据和指导。

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Synchronization of the cell cycle of Hela cell by hydroxyurea in vitro

WANG Yu1,2,LU Zhong-yi2,XU Feng2,et al.
(1.Department ofPediatric,the Southwest Hospital,the Third military Medical University,Chongqing400038,China;2.Department of Emergency,Chongqing Medical University Affiliated Children′s Hospital,Chongqing400014,China;3.Department ofPharmacology,Chongqing Medical University Affiliated Children′s Hospital,Chongqing400014,China;4.Department of Oncology,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing400016,China;5.Department of Radiation Oncology&Image-applied,Therapy Kyoto University Graduate School of Medicine,J apan)

Objective To explore the method to synchronize Hela cell by hydroxyurea.Methods Culture Hela cell,add HU 1 nm to the culture medium,synchronized the Hela cell for 24 h,then release HU from the culture medium.Design the specific time course for Hela cell;proved by flow cytometry.Results After release HU,3.5 h later,Hela cell could be synchronized in S phase,8.5 h later in G2/M phase,and 18 h later in G1phase.Conclusion Hela cell can be successfully synchronized in G1,S,G2/M phase by the HU treatment and releasing.

hydroxyurea;hela cell;cell cycle;synchronization

10.3969/j.issn.1671-8348.2010.24.012

R329.28;R979.1

A

1671-8348(2010)24-3331-02

△通讯作者,E-mail:zhuyuxi17@hotmail.com。

2010-06-23

2010-08-25)