双功能化胶体金纳米探针的制备及其特异性考察

杨 冰,黄乐群

(南京大学医学院,江苏南京 210093)

双功能化胶体金纳米探针的制备及其特异性考察

杨 冰,黄乐群

(南京大学医学院,江苏南京 210093)

目的：制备一种新型的双功能化胶体金纳米探针,并考察其特异性。方法：选择二硫化物分子和甲型流感病毒 (H1N1亚型)HA基因中特异性的 23 mer寡核苷酸片段组装到胶体金颗粒表面,制成双功能化胶体金纳米探针 (识别探针,颜色呈酒红色);利用磁性微球作为固相支持物,偶联另一段特异性 H1N1寡核苷酸片段制成捕捉探针;两者与靶 DNA(完全匹配 DNA)结合,形成无色的捕捉探针-靶 DNA-识别探针 (“三明治”夹心式复合物),并采用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱 (MALD I TOFMS)测定。同时,在选择向体系中分别加入超纯水 (作为空白对照)、完全匹配 DNA、不完全匹配DNA及 2条仅有 1个碱基错配的DNA片段作为靶目标进行实验,观察体系颜色变化及质谱测定,考察探针的特异性。结果：捕捉探针和识别探针只能与完全匹配DNA结合,形成夹心式复合物,反应体系颜色由酒红色转变为无色,充分洗涤后加热去杂交,则由无色复呈酒红色,质谱检测出现信号 (m/z 693);而其他靶目标 (不完全匹配 DNA及 2条仅有 1个碱基错配的DNA片段)和空白对照实验,不能与 2种探针形成夹心式复合物,反应体系均没有颜色变化 (仍呈现酒红色),充分洗涤后体系呈无色,加热去杂交体系仍呈无色,质谱检测未见信号 (m/z 693)。这说明胶体金纳米探针的特异性很高,可区分仅有 1个碱基错配的靶目标。结论：本研究建立了一种新型的自组装双功能化胶体金纳米探针,其制备过程简单、特异性很高。此类型胶体金纳米探针在核酸分析,尤其是疾病早期诊断,寡核苷酸多态性分型等方面将有广泛的应用前景。

核酸探针;胶体金;磁力学;微球体;光谱法,质量,基质辅助激光解吸电离;纳米技术

[J ZhejiangUniv(Medical Sci),2010,39(3)：296-304.]

随着DNA双螺旋结构的发现和人类基因组计划的完成,现代医学研究的重点已经深入到以基因和蛋白质为主要研究目标的分子水平。目前,现有的各种生物分析方法中,常常需要使用各种标记物进行标记,这些标记物有：放射性元素、荧光素及酶[1-3]等,采用这些标记物标记的探针进行检测,除具有操作复杂、费时等缺陷外,还各自都存在着其它一些不足之处。例如：放射性元素标记探针虽灵敏度较高,但却存在着放射性危害等安全隐患;荧光素标记探针价格昂贵,并且存在激发光谱窄、发射光谱宽、拖尾造成谱峰重叠以及易于光漂白和光解等缺点;酶作为探针标记物仍然无法克服其自身容易失活,不便长期保存等缺陷。

基于纳米材料的基因检测技术是近十年迅速发展起来的新兴技术,越来越受到生物学、医学和化学等领域的重视,逐渐成为生物分析化学的有力工具之一[4-5]。胶体金是研究较早的一种纳米材料,具有很好的生物相容性。它具有卓越的稳定性、高灵敏度和大批量可重复性,因其颗粒小、表面积大以及可标记多种物质等特点,逐渐成为一种理想的标记物。曾有报道,把生物分子标记于胶体金表面可以大大提高生物分子之间的结合能力[6],并且标记了胶体金的核酸具有更高的杂交特异性;同时,单链DNA的修饰也更有利于胶体金的稳定[7]。近年来,美国西北大学的Mirkin课题组在胶体金纳米探针的制备与应用方面做了大量工作。将DNA偶联于胶体金颗粒表面构成纳米探针,通过与靶 DNA的杂交,再联用其他分析技术,例如扫描法、比色法、光谱法及银染[8-11]等检测方法建立新的基因检测手段已成为一种趋势。在基因序列的识别和点突变检测、免疫检测、基因表达和寡核苷酸多态性[8,12-14]等方面也进行了许多具有开创性的工作。目前,胶体金制成的纳米探针用于检验 DNA的方法已逐渐引起人们广泛关注,在分子诊断学领域显示出光明的发展前景。

本研究采用柠檬酸三钠还原氯化金溶液生产 13-nm胶体金颗粒,用于胶体金纳米探针制备。选择三甘醇二硫化物分子作为标记物,选择 23 mer甲型流感 (H1N1)HA基因的特异性寡核苷酸片段作为识别序列,同时将两者组装到胶体金颗粒表面制成胶体金纳米探针,建立一种新的胶体金标记方法,为分子生物学研究及临床医学诊断提供一种新的基因检测手段。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 旋转蒸发仪 (Buchi R-200,德国),水浴箱 (Buchi B-490,德国 ),SHB-AA循环水式多用真空泵 (河南省太康科教器材厂),85-1磁力搅拌器 (上海志威电器有限公司),WYK-85B型温度液位多用途控制仪 (扬州师范学院教学仪器厂),DH-Ⅱ型 DNA混合器 (浙江宁波新芝生物科技股份有限公司),质谱(BrukerUltraflexⅢT OF/T OF mass spectrometer,德国)。

三甘醇 (Alfa Aesar),11-溴-1十一烯 (Alfa Aesar),偶氮二异丁氰 (AR,南京化学试剂有限公司),硫代乙酸 (CP,国药集团化学试剂有限公司),甲醇钠 (CP,南京化学试剂有限公司),碘 (AR,上海试四赫维化工有限公司),硫代硫酸钠 (AR,南京化学试剂有限公司),氢氧化钠(AR,南京化学试剂有限公司),浓盐酸 (AR,南京化学试剂有限公司),柱层析硅胶 (试剂级,300-400目,青岛海洋化工厂),硅胶层析板 (G,青岛海洋化工厂),正己烷 (AR,南京化学试剂有限公司),石油醚 (AR,北京长海化工厂),丙酮 (AR,南京化学试剂有限公司),甲醇 (AR,国药集团化学试剂有限公司),二氯甲烷 (AR,国药集团化学试剂有限公司),乙酸乙酯 (AR,国药集团化学试剂有限公司),氯金酸 (99.9%)(上海久岳化学有限公司),巯基修饰 DNA合成与纯化 (Takara,大连),磁性微球 (Invitrogen,上海),二甲亚砜 (DMSO)(Sigma,美国),琥珀酰亚胺 (S MPB)(Pierce,美国 ),超纯水 (经SartoriusArium 611体系纯化)。

1.2 二硫化物的化学合成[15-16]

1.2.1 1-十一烯-11-三乙烯基乙二醇 (Undec-l-en-11-yltri(ethylene glycol))(3a)的制备 将50%氢氧化钠 (NaOH)溶液 2.0 ml和三甘醇0.2 mol,在氮气 (N2)保护下,硅油浴 100℃反应 30 min,然后加入 11-溴-1-十一烯 20.0 mmol,反应 24 h。溶液由黑褐色转变为红棕色澄清溶液,冷却至室温,正己烷萃取,合并萃取液,减压浓缩,得黄色油状液体。硅胶柱色谱分离纯化,洗脱液为石油醚 /丙酮 /甲醇 (V/V/V)=64/16/1,得到油状液体 (3a)5.6 g,收率为97%。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ1.19～1.27(br s,12H),1.51～1.55(qui,2H),1.94～1.99(q,2H),2.63(br s,1H),3.37～3.42(t,2H),3.46～3.65(m,12H),4.84～4.95(m,2H),5.70～5.83(m,1H);ESI(m/z)：324.9[M+Na]+。

1.2.2 1-硫代乙酰基十一烷-11-三乙烯基乙二醇([1-[(Methylcarbonyl)thio]undec-11-yl]tri(ethylene glycol))(3b)的制备 将 (3a)5.0 g溶于甲醇配制成 200～400 mmol/L的溶液,加入 2～4倍的硫代乙酸和偶氮二异丁氰,混合均匀,倒入紫外反应管,连接紫外反应器,通氮气30 min后,开冷凝水,450 nm紫外灯照射 4～6 h。合并反应液,减压浓缩,得淡黄色油状液体。硅胶柱色谱分离纯化,石油醚 /丙酮 /甲醇 (V/V/V)=30∶10∶1洗脱 ,得到油状液体 (3b)3.9 g,收率为 58%。1H NMR(300 MHz,CDCl3)：δ1.21～1.26(br s,14H),1.52～1.58(m,4H),2.23(s,3H),2.82～2.87(t,2H),3.41～3.45(t,2H),3.48～3.67(m,12H);ESI(m/z)：401.6[M+Na]+。

1.2.3 1-巯基十一烷-11-三乙烯基乙二醇 ((1-Mercaptoundec-11-yl)tri(ethylene glycol))(3c)的制备 将 (3b)3.5 g溶于 100 ml甲醇,氮气保护下温度降至 0℃,投入甲醇钠 25 mmol,反应 30 min,用浓盐酸调节 pH值至 4.0,减压浓缩,得淡黄色油状液体。硅胶柱色谱分离纯化,洗脱液为二氯甲烷 /甲醇 (V/V)=40∶1,得到白色至淡黄色油状液体 (3c)2.0 g,收率约为60%。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ1.14～1.19(br s,14H),1.19～1.25(t,1H,),1.43～1.49(m,4H),2.45～2.52(q,2H),2.82～2.87(br s,1H),3.32～3.39(t,2H),3.45～3.67(m,12H);ESI(m/z)：359.4[M+Na]+。

1.2.4 11-十一烷基-三乙烯基乙二醇二硫((1-Mercaptoundec-11-yl)tri(ethylene glycol)disulfide 2))(3d)的制备 将 (3c)1.5 g溶于35 ml甲醇,加入碘 2 mmol,室温反应,薄层色谱 (TCL)检测至反应终止。减压浓缩,乙酸乙酯溶解,然后用硫代硫酸钠饱和溶液洗涤,至水层溶液澄清为止。减压浓缩,得橙黄色蜡状固体,硅胶柱色谱分离纯化,洗脱液为二氯甲烷/甲醇 (V/V)=100∶1至 70∶1,梯度洗脱 ,得到白色至淡黄色蜡状固体 (3d)1.1 g,收率为 79%。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ1.25(br s,28H),1.53～1.67(m,8H),2.62～2.69(t,4H),3.38～2.44(t,4H),3.48～3.67(m,24H),3.67～3.74(m,2H);13C NMR(300 MHz,CDCl3)δ72.55,71.54,70.59,70.57,70.33,70.00,61.68,39.15,29.54,29.50,29.47,29.45,29.20,29.16,29.81,28.51,26.05;ESI(m/z)：693.8[M+Na]+。

1.3 13-nm胶体金颗粒的合成 此方法是由Frens在 1973年创立[17],程序简单,制备的胶体金颗粒大小均匀,故应用十分广泛。本研究采用超纯水 (18.2MΩ·cm)将氯金酸 (HAuCl4)配制成溶液 (1 mmol/L,500 ml),加热、中速搅拌至沸腾,快速加入柠檬酸三钠溶液 (38.8 mmol/L,50 ml),快速强力搅拌,溶液颜色由亮黄色渐渐变成酒红色,继续反应 15 min,停止反应冷却至室温,4℃保存。透射电子显微镜(TEM)检查其粒径及均匀度,并紫外-可见光(UV-Vis)光谱扫描其最大吸收,并与双标记的胶体金颗粒进行比较。

1.4 胶体金纳米探针的制备 采用文献报道方法[18-19],将一端带有巯基修饰的寡核苷酸片段组装到胶体金表面,并将合成的三甘醇二硫化物分子也组装到胶体金颗粒表面,制成双功能化纳米探针。其制备过程见图 1a。取按上述方法制备的胶体金溶液 2 ml,加入超纯水溶解的 1.5μmol/L H1N1-DNA(表 1)溶液 200 μl,室温 (25℃)下轻轻振摇 24 h(20 r/min)。然后,加入磷酸缓冲溶液 1(PBS1：0.3 mol/L NaCl,10 mmol/L phosphate buffer(PB),pH 7.0),使体系 NaCl浓度至 0.1 mol/L,轻轻振摇36 h。再加入三甘醇二硫分子 (其加钠分子离子峰质核比 (m/z)为 693)10μl(100 mmol/L,乙醇配制),继续轻轻振摇 12 h,即得双功能化的胶体金纳米探针 (NPs),也可称为识别探针。4℃保存。识别探针临用前,高速 (12 000 r/min)、低温 (4℃)离心 25 min,除去上清液,以磷酸缓冲液 (PBS2：0.1 mol/L NaCl,10mmol/L PB,pH 7.0)洗涤 3次,最后分散于 PBS1溶液中,待用,其浓度大约为 5 nmol/L。

1.5 捕捉探针的制备[10-11]其制备过程见图1b。取 2.8μm表面修饰氨基基团的磁性微球(30 mg/ml)300μl,二甲亚砜 (DMSO)洗涤,加入偶联剂琥珀酰亚胺 (S MPB)使氨基基团活化,加入一端带有巯基修饰的寡核苷酸片段(表 1),室温振摇 10 h,用磷酸缓冲液 3(0.15 mol/L NaCl,0.1 mol/L PB,pH 7.0)洗涤 ;再加入72μmol/L钝化 DNA 100μl(表 1),继续振摇 10 h,用磷酸缓冲液 4(0.2 mol/L NaCl,10 mmol/L PB,pH 7.0)洗涤,最终分散于 2 ml 0.3 mol/L NaCl,10 mmol/L磷酸缓冲液 (pH 7.2)中,即得捕捉探针,其浓度为 4.5 g/L,4℃保存备用。

表1 组装在探针表面的寡核苷酸及靶目标的序列Table 1 Oligonucleotide strands sequences ofmodified probes and different targets

图1 双标记胶体金纳米探针和捕捉探针的制备过程Fig.1 Preparation of the NPs and theMPs

图2 形成“三明治”夹心式复合物的过程Fig.2 “Sandwich”the process of sandwich-type complexes

1.6 “三明治”夹心式复合物的形成 其过程见图 2。向含有 30μl靶目标 (表 1)溶液 (其浓度为 10 nmol/L)的体系中依次加入 50μl捕捉探针和 50μl识别探针,再加入饱和氯化钠磷酸溶液 (用磷酸缓冲液 1配制,浓度大约为 6 mol/L,25℃),45℃温孵 10 min,室温轻轻振摇 1 h,洗涤,最终用10μl超纯水分散。

1.7 质谱测定 将上述夹心式复合物溶液在 75℃温孵 5 min,观察颜色变化,同时取上清液质谱测定。MALD I TOF MS的检测条件为：离子源 1和离子源 2的加速电压分别为 25 kV和 21.55 kV,线性正离子扫描模式,棱镜的加速电压为 9.5 kV,反射元件 1和反射元件 2的加速电压分别为 26.3 kV和 13.85 kV,最适激光强度为30%。用 2μl的去杂交产物点靶(Anchor-Chips,400/385)。以 15个单位的腺嘌呤 (A15)自组装的胶体金颗粒作为基质,检测二硫化物分子的加钠分子离子峰 ([M+Na]+),其质核比 (m/z)为 693。

1.8 探针特异性和灵敏度考察探针的特异性和灵敏度对评价探针质量优劣十分重要。为考察探针的特异性,本研究同时进行如下实验：向含有 50μl捕捉探针和 50μl识别探针的体系中,分别加入 30μl浓度均为 10 nmol/L的完全匹配 DNA、完全不匹配 DNA、与捕捉探针有 1个碱基不匹配的 DNA、与识别探针有 1个碱基不匹配的 DNA(表 1)和超纯水 (作为空白对照),按上述方法进行实验,观察反应体系颜色变化 ,并 MS测定。

为考察胶体金纳米探针的灵敏度,本研究进行了 5个不同靶 DNA浓度包括 0 mol/L、10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L的实验,每个浓度平行实验 3次。其他实验过程同特异性实验。

2 结 果

2.1 TEM及 UV-Vis检测结果

TEM显示柠檬酸钠还原法制备的胶体金颗粒,其粒径介于 12～14 nm(图 3A),粒径均匀,分散度好,这对进行修饰是一个很好的基础。曾有文献报道胶体金颗粒在高达 1 mol/L的氯化钠溶液、磷酸缓冲液、硼酸溶液、丙磺酸溶液或者含有金属离子和小分子的溶液等多种体系中都具有良好的稳定性[9,20],但适宜的离子浓度及温度对于胶体金保持良好分散,减少聚集是很重要的。从图 3A和图 3B可知,未经标记的胶体金颗粒表面光滑,界面清晰;而经标记的胶体金颗粒则表面模糊,周围长满灰色的“绒毛”,表明 H1N1寡核苷酸片段及二硫化物分子已标记到胶体金颗粒表面。且如图 3所示双标记的胶体金纳米探针并未使胶体金颗粒发生聚集,仍可稳定存在,分散性好。另外,胶体金颗粒的光谱特性也可说明其制备质量优劣及标记效果。胶体金随粒径的增大,对应吸收峰的峰位呈现向长波段红移的趋势[21]。对于 13-nm的胶体金颗粒,其最大吸收波长在 520 nm左右。从图 3c的 UV-Vis光谱扫描图可以看出,进行双标记的胶体金纳米探针其最大吸收峰的波长红移了大约 2.0 nm(标记前后最大吸收峰波长分别是 520和 522 nm)。并且从图中可以看出经过双标记的胶体金同未经标记的胶体金相比,其 UV-Vis光谱扫描图图形较平坦,这些都充分说明H1N1寡核苷酸链及二硫化物分子已标记到胶体金颗粒的表面,使纳米金粒子尺寸和形状有所改变,从而改变了胶体金颗粒的光谱学特征。

2.2 探针特异性考察结果 双标记的胶体金纳米探针呈鲜艳的酒红色,和捕捉探针遇到靶 DNA时,按照碱基互补原理形成“捕捉探针-靶 DNA-识别探针”夹心式复合物,此时识别探针的酒红色褪去,反应体系呈无色。加热去杂交破坏夹心式结构,使识别探针 (即双功能化的纳米探针)从夹心式结构中释放出来,此时体系复呈酒红色,MALD I TOF MS测定在 m/z 693的位置有 1个三甘醇二硫分子的加钠分子离子峰 ([M+Na]+)(图 4b)。当加入超纯水作为空白对照实验 (图 4a)和加入完全不匹配 DNA(图 4c)及 2条仅有 1个碱基不匹配的 DNA(图 4d和图 4e)实验中,温孵杂交后体系仍然呈现酒红色;去杂交后,反应体系也不会显酒红色;同样,MALD I TOF MS测定在 m/z 693的位置也没有峰出现,这是因为夹心式复合物没有形成,说明 2种探针的特异性很好,可以区分仅有 1个碱基不匹配的 DNA。2.3 探针灵敏度考察结果 捕捉探针与双标记的胶体金纳米探针遇到一系列不同浓度的靶DNA进行探针灵敏度实验。由图 5可知,按照碱基互补原理形成“捕捉探针-靶DNA-识别探针”夹心式复合物,加热去杂交破坏夹心式结构,使识别探针从夹心式结构中释放出来,采用MALD I TOFMS测定二硫化物分子的加钠分子离子峰 ([M+Na]+),其质核比 m/z为 693。这种检测靶 DNA方法的灵敏度可达 1 pmol/L(10-12mol/L)。

图3 13-nm胶体金颗粒经 H1N1寡核苷酸片段和二硫化物分子双标记制成胶体金纳米探针前后比较Fig.3 Comparision of 13-nm golden colloid particles without and with dual-functionalized with single-strand oligonucleotide of influenza A virus(H1N1) and disulfide molecules

图4 捕捉探针和识别探针特异性考察结果Fig.4 Specification investigation results of theMPs and the NPs

图5 胶体金纳米探针的灵敏度实验结果Fig.5 The sensitivity results of colloidal gold nano-probe

3 讨 论

二硫化物以及胶体金的合成会影响双功能化胶体金纳米探针的制备。本研究使用的三甘醇二硫分子在其合成的第三步产生的是巯基化合物,因其自身不稳定倾向于两两分子连接成二硫化物,且此巯基化合物的胶体金自组装效果不佳;而在第四步氧化成二硫分子后,此化合物稳定性提高,与胶体金的结合效果较好。故选择二硫化物分子而非第三步产生的巯基化合物作为标记物。目前,对于含硫小分子与胶体金之间的结合到底是化学键还是静电引力,还不是很清楚。另一方面,在胶体金合成过程中,加入不同量的还原剂可制成粒径大小不同的胶体金颗粒。影响胶体金质量的因素主要包括：反应物的浓度、反应搅拌混匀程度、反应物加料顺序、反应温度、反应器的材料及反应物的纯净度,尤其是水。其中,反应物搅拌混匀程度是至关重要的一个因素。另外,在反应结束后冷却的过程中,继续强力搅拌也有助于胶体金粒径均匀,分散性好。

在本研究中,组装到金纳米粒子表面的寡核苷酸片段具有特异性识别靶目标 DNA的功能,可称之为识别分子;组装到金纳米粒子表面的三甘醇二硫分子,其不但可作为与靶 DNA对应和指示靶目标存在的质量条码 (reporter masscode)被质谱检测,而且因其数量远远大于表面DNA的数量,对靶目标具有信号放大功能,可称其为编码分子。另外,选择磁性微球制备成的捕捉探针作为固相支持物,它通过碱基互补配对原理从被分析物中“抓出”靶目标,再与胶体金纳米探针形成捕捉探针-靶目标-胶体金纳米探针的“三明治”夹心式复合物。所以,捕捉探针具有分离靶目标、纯化夹心式复合物和富集靶目标的作用,对本方法检测灵敏度的提高尤为重要。曾有文献报道[22],采用胶体金纳米探针进行 DNA检测,其检测灵敏度可达z M水平。因其灵敏度高,DNA检测不需要PCR扩增。本研究建立的制备双功能化胶体金纳米探针在实验条件未经任何优化的条件下,灵敏度可达 1 pmol/L水平 (图 5)。本课题组今后的工作将集中在如何提高检测灵敏度,使其成为可以应用于临床的基因分析手段。提高检测灵敏度的方法主要包括下面 2个方面：一是提高纳米探针表面编码分子和识别分子的比例,两者的比例就是靶 DNA信号扩大的倍数;二是提高杂交效率,这步可通过提高反应体系的盐离子浓度完成。但是,对于一个表面积固定的胶体金颗粒,随着其表面编码分子数量的增加,与靶DNA互补配对的识别分子的数量必将减少,加之空间位阻的影响,杂交效率会降低[22]。因此,这需要对杂交条件、胶体金纳米探针的标记等多方面综合考虑进一步优化,才可得到较高的检测灵敏度。

为考察制备的新型胶体金纳米探针的特异性,本研究将其与不同的靶目标进行了杂交实验。结果显示,探针除可以与完全匹配 DNA进行杂交形成夹心式复合物,产生颜色变化,质谱测定出现信号外,其他不同形式的靶目标,尤其是仅有 1个碱基突变的靶 DNA序列,包括与捕捉探针序列 1个碱基错配和与识别探针序列 1个碱基错配两种情况,均不能与探针进行杂交形成夹心式复合物,反应体系无颜色变化,质谱测定未见信号。这充分说明本研究制备的胶体金纳米探针具有很高的特异性,这对基因分析,尤其是在临床诊断上意义重大。综上所述,本研究建立了在胶体金表面同时组装二硫化物分子和寡核苷酸链制备成双功能化胶体金纳米探针的方法,磁性微球制成的捕捉探针与靶目标形成“三明治”夹心式复合物,采用MALD I TOF MS检测的新方法有如下优点：实验原理通俗易懂,探针制备操作简单、灵敏度高、特异性高。其灵敏度在探针制备方法和杂交体系未经优化的情况下,达到 10-12mol/L水平;其特异性高,能区分靶目标序列中仅有 1个碱基错配的 DNA序列,这对 DNA检测尤为重要。因此,采用胶体金纳米探针进行基因分析的方法将具有更广阔的应用前景。另外,本研究建立的检测甲型流感病毒的方法,可以为甲型流感病毒的临床早期快速诊断提供一个新思路与新方法。

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[责任编辑 黄晓花 ]

Self-assembly of dual-functionalized gold nanoparticle probe and its specificity

YANGBing,HUANGLe-qun(M edical School,N anjing University,Nanjing210093,China)

Objective：To investigate the specificity of the dual-functionalized nanopaticle probes(NPs)self-assembled with colloidal gold.M ethods：13-nm gold nanoparticleswere preparedwith citrate reduction of HAuCl4.These gold nanoparticles were sequentially functionalized with the specific singlestrand oligonucleotide of HA gene of influenza A virus(H1N1)and disulfide molecules of m/z at 693.The NPs solution showed the red for mation.The magnetic microparticles(MPs)were modified with another specific single-strand oligonucleotide in HA gene of H1N1.The sandwich complexes(MP-Target-NPs)were for med by the target DNA with the MPs and the NPs.The color change in the solution was observed and the dehybridization product was detected by MALD I TOF MS.Moreover specificity of the probeswas investigated with nanowater(as a blank control)and the different target DNAs including complementary DNA,non-complemetary DNA and two DNAs of one base mismatch,respectively.Results：The red formation and the positive signal in MS detection of reporter mass code 693([M+Na]+)were observed,which indicated the formation of sandwich complexes for med only when the completely complementary targetDNAswere presented in the solution.No color for mation changes and no peak signal detected byMALD I TOFMSwere observed,showing that none of target of interest(nanopure water),non-complementary DNA and two DNAs of one base mis match existed in the systems,which indicated no sandwich complexes formed be tween the target DNAs and the two probes.Conclusions：Considering the simple preparation procedure and high specificity,the dual-functionalized gold nanoparticle probeswould be widely and increasingly used in nucleic acid analysis.In particular,itwould have broad application prospects in early diagnosis of diseases,single nucleotide polymorphis m (SNP)typing and so on.

Nucleic acid probes;Gold colloid;Magnetics;Microspheres;Spectrometry,mass,matrix-assisted laser desorption-ionization;Nanotechnology

2010-01-20

2010-03-20

国家教育部归国华侨学者科研基金(No.0214168001).

杨 冰 (1975-),女,博士,从事药物分析研究.

黄乐群 (1955-),男,博士,教授,从事分析化学研究;E-mail：huanglq@nju.edu.cn.

http：∥www.journals.zju.edu.cn/med DO I：10.3785/j.issn.1008-9292.2010.03.014

Q 67;Q 781

A

1008-9292(2010)03-0296-09