靶向造影剂(Gd-DTPA-Granzyme B)的制备

谢 易,刘广义,韩 飞,姜 虹,茅幼英,王慧萍,赵 杰,金 娟,陈江华

(浙江大学医学院附属第一医院肾脏病中心,国家中医药管理局三级实验室“肾脏病免疫实验室”,浙江杭州 310003)

靶向造影剂(Gd-DTPA-Granzyme B)的制备

谢 易,刘广义,韩 飞,姜 虹,茅幼英,王慧萍,赵 杰,金 娟,陈江华

(浙江大学医学院附属第一医院肾脏病中心,国家中医药管理局三级实验室“肾脏病免疫实验室”,浙江杭州 310003)

目的：探讨以颗粒酶 B为靶向的磁共振造影剂 (gadolinium-diethylenetriaminepentaaceticgranzyme B monoclonal antibody,Gd-DTPA-GB mAb)的制备方法及反应条件。方法：采用颗粒酶 B单抗制成颗粒酶 B靶向造影剂 Gd-DTPA-GB mAb;通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flightmass spectrometry,MALD I-TOF-MS)计算其相关参数,采用MTT法检测其细胞毒性,以及免疫组化法判定其免疫活性。结果：MALD I-TOF-MS鉴定结果显示：颗粒酶B单抗的质荷比高峰主要出现在 133986.41处,连接 Gd-DTPA后高峰主要在139736.06的位置;根据质谱结果计算得每分子抗体可以连接 20个左右的 Gd3+;MTT法结果显示：Gd、DTPA、Gd-DTPA,以及 Gd-DTPA-GB mAb组在浓度逐渐递增的情况下对于细胞活性没有明显影响,且 4组间比较差异无统计学意义 (P＞0.05);免疫组化结果显示：靶向造影剂 (1∶175)与阳性对照组 (1∶150)比较,具有较高的免疫活性。结论：在体外,本实验室设定的条件能够合成磁共振靶向造影剂 Gd-DTPA-GB mAb,而且该造影剂具有良好的免疫活性,无明显细胞毒性。

磁共振成像;三胺五乙酸;钆 DTPA;造影剂;钆;光谱法,质量,基质辅助激光解吸电离

[J ZhejiangUniv(Medical Sci),2010,39(3)：290-295.]

靶向磁共振技术是近年来产生的新型磁共振成像技术,主要有两类,一类是以钆 (Gd)为基础的顺磁性分子探针,能产生 T1阳性信号对比,有镧螯合剂和 Gd-DTPA及其衍生物;另一类为利用氧化铁的超顺磁性分子探针,能产生强烈的 T2阴性信号对比,可以是单晶体,也可以是涂有多糖的多晶体。其中以 Gd为基础的造影剂主要利用 Gd-DTPA与特异性载体分子如单克隆抗体结合,在后者的引导下,造影剂可以在该载体分子靶向的器官,机体某部位或疾病组织特异性浓聚,改变组织中周围水分子的 T1弛豫时间,从而形成特异性磁共振图像。同时,结合了载体分子的造影剂也可以增加造影剂在组织中的保留时间,延长增强效果[1-3]。Kurin[4]等将结肠癌细胞 (W iDr细胞)种植于裸鼠体表造成肿瘤模型,向其注射与单克隆抗体(针对W iDr细胞)结合的磁共振造影剂,可造成造影剂在肿瘤组织浓聚,清除时间明显延长。Boutry[5]等发现在大鼠暴发性肝炎模型中,以炎症介质 E-选择素为靶向的磁共振造影剂 Gd-DTPA-B(s Lex)A可以在病变肝脏组织中浓聚,相比于常规造影剂增强MRI,前者的强化效果更加明显,持续时间更长。与传统磁共振成像比较,靶向磁共振具备了较高的敏感性,同时新合成的靶向造影剂也能够克服非特异性造影剂的应用局限,对于疾病的早期诊断有一定的价值。目前磁共振靶向造影剂不仅在肿瘤靶向方面[6-7]比较热门,在炎症、血管等方面也有许多研究。

众所周知移植排斥反应具有明显的免疫反应激活与炎症细胞浸润过程,其中也涉及了许多免疫相关分子的特异性表达[8-9]。颗粒酶 B(Granzyme B)是细胞毒性 T淋巴细胞的主要效应分子,在急性排斥反应中,活化后的 T淋巴细胞释放颗粒酶 B进入靶细胞,激活核酸内切酶系统,使靶细胞 DNA断裂,引起靶细胞凋亡。Zhang[10]等发现在大鼠移植模型中,TCRα β+CD3+CD4

-CD8-T细胞主要通过穿孔素 /颗粒酶 B机制调控 T、B细胞反应,提示穿孔素 /颗粒酶B在大鼠移植物排斥中也起着重要作用。本中心的研究[11]也发现,移植肾急性排斥患者尿中穿孔素和颗粒酶B的表达上调,提示颗粒酶B对于移植肾排斥的早期诊断有一定的临床价值。为此,本研究利用抗颗粒酶 B单抗与 Gd-DTPA偶联,探讨其合成的最佳条件,以期合成一种新型磁共振造影剂,为移植肾急性排斥反应的研究建立更具特异性的早期无创诊断方法。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 DTPABA(Sigma公司,美国),二甲基酰胺 (上海生工,中国),颗粒酶 B单克隆抗体 (SPR ING公司,美国),GdCl3(上海生

工,中国 ),PD-10柱 (Amersham公司,美国 ),ABC三步法免疫组化检测试剂盒 (Vector Laboratories公司,美国),羊抗兔二抗 (Vector Laboratories公司,美国),磷酸盐缓冲液 PBS(粉剂)(福州迈新生物技术开发公司,中国),DAB显色试剂盒 (福州迈新生物技术开发公司,中国),0.01 mol/L柠檬酸组织修复液 (福州迈新生物技术开发公司,中国),其它试剂均为国产分析纯产品。

1.2 主要仪器 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALD I-TOF-MS,Voyager-DE STR 4349,美国应用生物系统公司),Leica(I CCA)光学显微镜 (Leica公司,德国),Leica2000自动封闭式脱水机 (Leica公司,德国),Leica RM2145石蜡切片机 (Leica公司,德国),Leica展片机 (Leica公司,德国),苏泊尔 A20压力锅(浙江苏泊尔炊具股份有限公司,中国),Siemens电冰箱 (Siemens公司,德国),电热恒温干燥箱 (上海精宏医疗仪器厂,中国),电子天平 (FA1104型,上海天平仪器厂,中国),微量加样器 (Eppendorf公司,德国),调速多用振荡器 (Genie公司,美国)。

1.3 MR I造影剂 Gd-DTPA-GB mAb制备 将1 mgDTPABA溶于 1 ml二甲基酰胺,配成 1 g/L DTPABA溶液,将 10 g/L颗粒酶 B抗体 400 μl加入 1 g/L DTPABA溶液 400μl,室温孵育 1 h。PD-10柱子纯化,加 0.5 mol/L NaAc 3.5 ml洗脱。收集洗脱液,用 Bradford法测定抗体浓度,检测蛋白洗脱情况。8.18 ng GdCl3加入0.5 mol/L NaAc 420μl,取 160μl该液加入洗脱液中,室温振荡 1 h。PD-10柱子纯化,用0.15 mol/L NaCl洗脱 ,收集洗脱液 ,1 ml管分装,4℃存放。

1.4 Gd-DTPA-GB mAb的体外试验

1.4.1 鉴定 Gd-DTPA-GB mAb造影剂及连接效率 Gd-DTPA-GB mAb用MALD I-TOF-MS光谱测定是否连接,并根据增加的分子量计算每分子抗体连接的 Gd3+数量。

1.4.2 细胞毒性检测 收集对数生长期人类肾小管上皮细胞(本实验室提供),调整细胞悬液浓度,接种于 96孔板,每孔加入 100μl培养液。5%CO2、37℃孵育,至细胞单层铺满孔底;然后,设空白对照组及实验组,其中实验组分别加入一定浓度梯度的 Gd-DTPA-GB mAb、DTPA、Gd-DTPA及 Gd,每组各设 3个复孔,孵育 12 h,倒置显微镜下观察。每孔加入 20μl MTT溶液 (5 g/L),继续 37℃培养 1 h。弃上清,每孔加入 150μl异丙醇,振荡,使结晶物充分溶解。将结晶溶解后的上清液移到酶标板上测 570 nm吸光值。存活率 =(实验孔 OD/对照孔 OD)×100%,(OD值取平均值);抑制率(或增值率)=100%-存活率。以存活率 (y轴)与药物浓度 (x轴)绘图,如出现抑制情况需计算半数抑制浓度 (I C50)值。结果判断：抑制率 ＞70%为高度敏感,50%～70%为中度敏感,＜50%为不敏感。

1.4.3 Gd-DTPA-GB mAb的免疫活性检验取雄性成年 SD大鼠移植甲状腺组织,常规石蜡包埋切片,分为实验组 (一抗 Gd-DTPA-GB mAb)、阳性对照组 (一抗 GB mAb)及阴性对照组 (一抗 PBS)。采用 ABC法 (avidin-biotinperoxidase complexmethod)。①具体步骤：甲状腺组织应用标准方法制成蜡块,常规切片,烤片,脱蜡;3%过氧化氢室温湿盒孵育 10 min,PBS冲洗;0.01 mol pH 6.0柠檬酸抗原修复液修复,高压冒气 3 min,压力锅离开热源,冷却至室温,PBS冲洗;每张切片滴加非免疫动物血清,孵育 20 min;阳性对照组切片滴加 1∶150的抗颗粒酶 B单克隆抗体稀释液,阴性对照组加PBS液,实验组滴加 1∶175的 Gd-DTPA-GB mAb造影剂稀释液,湿盒 4℃冰箱过夜;PBS冲洗,每张切片滴加生物素化二抗,室温湿盒孵育60 min;PBS冲洗,每张切片滴加 ABC复合物,室温湿盒孵育 60 min;PBS冲洗,滴加新鲜配制的 DAB溶液,显微镜下显色;自来水冲洗,苏木素复染;脱水、中性树胶封固;显微镜下观察。②免疫组化结果判定：颗粒酶 B免疫阳性细胞呈棕色,由于颗粒酶 B蛋白主要分布于细胞膜、细胞浆,因此阳性细胞胞膜、胞浆染色较深。通过免疫组化法比较三组之间的阳性结果表达量,从而判定 Gd-DTPA-GB mAb的免疫活性。

1.5 统计学分析 细胞毒的实验数据采用均数 ±标准差,用 SPSS 13.0统计软件进行分析,计量资料多组间比较采用单因素方差分析,统计学显著性检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1 Gd-DTPA-GB mAb的鉴定及连接效率计算 MALD I-TOF-MS鉴定 Gd-DTPA-GB mAb连接产物,结果显示：颗粒酶 B单抗的质荷比高峰主要出现在 133986.41处 (图 1A);连接了Gd-DTPA后,分子量增加,显示质荷比高峰后移,主要在 139736.06的位置 (图 1B),表明Gd-DTPA-GB mAb已连接成功。Gd-DTPA分子量约为 500 D,通过计算增加的分子量,每分子抗体可以连接 20个左右的 Gd3+。

2.2 细胞毒性检测 MTT法实验结果显示：Gd、DTPA、Gd-DTPA以及 Gd-DTPA-GB mAb组在浓度逐渐递增的情况下对于细胞活性没有明显影响 (P＞0.05),且 4组之间差异无统计学意义。这表明本研究合成的 Gd-DTPA-GB mAb对于人类肾小管上皮细胞没有明显的细胞毒性作用 (图 2)。

2.3 Gd-DTPA-GB mAb的免疫活性检验 从颗粒酶 B阳性的组织切片上 (图 3C)可见棕黄色沉积物主要位于间质淋巴细胞的胞浆,典型的形状为颗粒状;在颗粒酶 B阴性的组织切片上间质淋巴细胞胞浆无棕黄色沉积物存在 (图3A)。我们新合成的造影剂 Gd-DTPA-GB mAb因连接了颗粒酶 B抗体,故理论上可以与相应抗原结合,免疫组化结果显示具有免疫阳性细胞 (图 3B)。

3 讨 论

MR I具有无创,无辐射,空间分辨率高等特点,但传统MR I主要依赖非特异性成像手段进行检查,所以只有当机体发生明显的病理或解剖结构改变时才能发现异常,而靶向磁共振造影剂先以双功能络合剂偶联单克隆抗体,再将磁共振造影剂与之结合,利用载体本身与靶点作用时所具有的特异性、亲和性及稳定性来构建。DTPA作为一种多氨多羧化合物具有鳌合能力强,标记简便,作用高效等特点,而 Gd3+由于有 7个未成对电子,自旋磁矩大,电场对称,弛豫效率高,易与水配位,且配位水分子为 8、9个,是设计单抗性造影剂最理想的选择[12]。自Gd-DTPA问世后,就有学者用磁共振造影剂Gd标记单抗用于靶向诊断肿瘤[4,6-7]。近年来靶向造影剂的研究更侧重于敏感性和特异性的提高,应用范围也日趋扩大,进一步提示我们能否在移植领域展开相应的研究。

图1 MALD I-TOF-MS检测 Gd-DTPA-GB mAb结合产物Fig.1 Petection of Gd-DTPA-GB mAb UsingMALD I-TOF-MS

图2 MTT检测 Gd、DTPA、Gd-DTPA及 Gd-DTPA-GB mAb组的细胞毒性Fig.2 UsingMTT assay for cytotoxicity test

图3 Gd-DTPA-GB mAb的免疫活性检验Fig.3 Using immunohistochemistry for immune activation

从已有的研究来看,靶向磁共振最大的问题在于是否有足够的造影剂可以达到靶组织或靶细胞,以及这些造影剂是否能够产生足够的信号。由于颗粒酶 B在移植排斥组织中高表达[13],所以本实验采用颗粒酶B抗体与颗粒酶B高亲和力的特性来实现靶向成像。为了提高磁共振造影剂的敏感性,增加其在靶器官的浓度,有学者[14-15]采用一系列的连结技术来提高Gd3+摩尔浓度,以产生足够强的 T1信号。本研究结果表明,Gd3+能够通过简单的螯合反应和DTPA-mAb以相对较高的浓度结合。由于颗粒酶B抗体是一种大分子 IgG,所以选择小分子 Gd3+与之连接,使其容易穿过细胞膜与靶点结合;同时,Gd3+与大分子蛋白的结合还可以提高 T1信号的强度[16]。除此之外,保持造影剂的免疫活性也是非常重要的一个环节,具有免疫活性的造影剂才能与靶细胞顺利结合。本研究采用免疫组化的方法可以简便、直观地看到新合成的造影剂能与颗粒酶B阳性高表达的正常 SD大鼠甲状腺组织细胞特异性结合,说明其仍然具备较高的免疫活性。细胞毒性试验也表明,本研究合成的 Gd-DTPA-GB mAb对于人类NRK细胞没有明显的抑制作用。本研究首次成功制备了新型的靶向磁共振造影剂 Gd-DTPA-GB mAb。该造影剂在体外实验中可以特异性的结合颗粒酶 B,具有良好的免疫活性,对人类肾小管上皮细胞没有明显的杀伤作用。可以进一步应用于动物实验的研究,为移植肾急性排斥反应的早期特异性影像诊断提供有价值的方法。

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[责任编辑 黄晓花 ]

Preparation of a novel targeted M R contrast agent Gd-DTPA-Granzyme B monoclonal antibody

XIE Yi,L IU Guang-yi,HAN Fei,J IANG Hong,MAO You-ying,WANG Hui-ping,ZHAO Jie,J IN Juan,CHEN Jiang-hua(Kidney D isease Center,The First Affiliated Hospital,College of M edicine,Zhejiang University,Hangzhou310003,China)

Objective：To prepare a novel MR I targeted contrast agent Gd-DTPA-Granzyme B monoclonal antibody(mAb)and to test its reaction conditions.M ethods：The Granzyme B mAb was coupled with DTPA,and then conjugated with Gd.The Gd-DTPA antibody was characterized using MALD I-TOF-MS.Cytotoxicity test was perfor med with MTT assay,and immune activation was examinedwith immunohistochemistry.Results：MALD I-TOF-MS demonstrated that the molecular weight shifted from granzyme B mAb(133986)to Gd-DTPA-GB mAb(139736),which indicated the conjugation of the antibodywith Gd-DTPA.Themolar ratio of Gd per IgGmoleculewas about 20.MTT assay showed that Gd,DTPA,Gd-DTPA and Gd-DTPA-GB mAb groups did notmake an impact on cell viability,and there were no significant differences among 4 groups(P＞0.05). Immunohistochemistry results showed that compared with the positive control group the targeted contrast agent had a high immune activity.Conclusion：The novel contrast agent Gd-DTPA-Granzyme B mAb prepared in this study keeps a good immune activity and has no significant cytotoxicity.

Magnetic resonance imaging;Pentetic acid;Gadolinium DTPA;Contrast media;Gadolinium;Spectrometry,mass,matrix-assisted laser desorption-ionization

R 914.5

A

1008-9292(2010)03-0290-06

2009-11-17

2010-04-20

国家自然科学基金 (项目编号 30671990);国家自然科学青年基金 (项目编号 30801148);115国家科技支撑计划 (项目编号 2008BA I60B04).

谢 易 (1983-),女,硕士研究生,从事靶向磁共振在肾移植排斥早期诊断方面的研究.

陈江华 (1958-)男,硕士,教授,主任医师,从事肾移植及多器官衰竭的研究;E-mail：chenjianghua@zju.edu.cn

http：∥www.journals.zju.edu.cn/med DO I：10.3785/j.issn.1008-9292.2010.03.013