亚砷酸钠对NIT-1细胞增殖及胰岛素基因表达的影响

王瑞,张冰荫,李莉,李媛媛,杨元元,慕晓玲

(石河子大学医学院∕新疆地方与民族高发病重点实验室,石河子832002)

亚砷酸钠对NIT-1细胞增殖及胰岛素基因表达的影响

王瑞,张冰荫,李莉,李媛媛,杨元元,慕晓玲

(石河子大学医学院∕新疆地方与民族高发病重点实验室,石河子832002)

为了观察亚砷酸钠(NaAsO2)对胰岛β细胞NIT-1增殖及胰岛素(Insulin)基因表达的影响,本实验使用不同浓度的NaAsO2(1,2,4,8,16和32μmol/L)分别不同时间(24 h和48 h)作用于NIT-1细胞,以MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR方法检测Insulin mRNA的表达。结果显示:1)NaAsO2对NIT-1细胞增殖活性的影响:当NaAsO2浓度小于2μmol/L的时候轻度促进NIT-1细胞增殖(P>0.05)。当NaAsO2浓度大于4μmol/L时抑制细胞增殖(P<0.01),细胞增殖抑制率随NaAsO2浓度的增加及作用时间的延长而增加(P<0.01)。2)NaAsO2(1,4和8μmol/L)对NIT-1细胞Insulin mRNA的表达的影响:作用24 h,各剂量组Insulin mRNA表达降低,其中8μmol/L组与对照组比差异有统计学意义;作用48 h,各剂量组 Insulin mRNA表达降低,其中4μmol/L组和8μmol/L组与对照组比差异有统计学意义。由此可得出砷对NIT-1细胞增殖及 Insulin基因表达的影响与作用时间、剂量有关,Insulin mRNA表达水平的改变可能是砷影响胰岛β细胞功能进而引发糖尿病的机制之一。

砷;NIT-1细胞;胰岛素基因;糖尿病

Abstract:T o investigate the effects of NaAsO2on proliferation and insulin mRNA expression of NIT-1 insulinoma cells(pancreatic isletβ-cells),NIT-1 cells were cultured with NaAsO2(1,2,4,8,16and32μmol/L respectively).NIT-1 cells were incubatedfor 24 and 48h,and then the vability were determined by MTT.Meanwhile,the levels of insulin mRNA expression were detected by RT-PCR method.The results display:1)The proliferation of NIT-1 insulinoma cells:The proliferation of NIT-1 insulinoma cells was slightly promoted by NaAsO2when its concentration was in 0-2μmol/L(P>0.05).However,the proliferation of NIT-1 insulinoma cells was inhibited by degrees in time-and dose dependant manner as the concentration of NaAsO2was higher than 4μmol/L(P<0.01).2)Insulin mRNA expression of NIT-1 insulinoma cells were evaluated in the presence of 1,4 and 8μmol/L NaAsO2for 24h and 48h:NaAsO2decreased insulin mRNA expression in all groups.We also showed a significant decrease in insulin mRNA expression of cells exposed to 8μmol/L NaAsO2during 24h and exposed to 4 or 8μmol/L NaAsO2during 48h.Our data suggest that acting on the timing and concentrations,arsenic can exert both stimulatory and inhibitory effects on the prolieration and insulin mRNA expression of NIT-1 insulinoma cells.Influnce of Arsenic on the alteration of insulin mRNA expression may be involved the function of pancreatic isletβ-cells and led to diabetes mellitus.

Key words:arsenic;NIT-1 insulinoma cells;insulin gene;diabetes mellitus

砷(As)是自然界中普遍存在的一种毒性很强的类金属元素,以不同的化学形式存在于自然界。人类摄砷的主要途径是饮水和食物,食物中含有机砷和无机砷,饮水中则主要含无机砷。砷的污染已严重影响许多国家的公众健康[1-2],我国青藏高原、云贵高原和新疆由于其地理环境的特殊性,现已查明部分地区存在砷、碘、氟、硒等异常,导致其相关疾病的发病率增加。慢性接触砷可以导致肺损伤、外周神经损伤、皮肤病或心血管病,并且是引起皮肤癌、膀胧癌、肝癌、肺癌的因素之一[3-5]。近年来大量流行病调查结果显示,长期接触砷可以导致糖尿病(diabetes mellitus,DM)的发生[6-10]。2002年 Tseng等[7]认为由环境因素慢性接触砷可引发2型糖尿病(T2DM)。胰岛素抵抗和β细胞功能障碍是 T2DM发病的两大机制,胰岛素抵抗是 T2DM发生的始动因素,而胰岛β细胞功能正常与否则是 T2DM是否发生的决定因素。

砷对胰岛β细胞功能的影响及其机制在砷与DM关系的研究中至关重要。本研究以转基因小鼠胰岛β细胞(NIT-1细胞)为研究对象,观察不同剂量NaAsO2作用不同时间后细胞活性,并采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Insulin mRNA的表达变化,初步探讨砷影响胰岛素β细胞功能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

NIT-1细胞株由华中科技大学同济医学院免疫学教研室提供。NaAsO2(美国Sigma公司),低糖胎牛血清培养液(DMEM)培养基(Gibco公司)、胎牛血清(FBS,Hyclone公司)、PBS平衡盐粉、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚酚(DMSO)、胰酶(美国Sigma公司)。RNA提取试剂(Trizol),(美国Invitrogen公司);逆转录体系、PCR体系(Fermentas公司)。Insulin引物、β-actin引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。无水乙醇等其他试剂均为国产分析纯以上等级。

1.2 方法1.2.1 NIT-1细胞培养

采用低糖DMEM培养基加10%的胎牛血清,置于37℃5%二氧化碳培养箱中进行培养,2-3 d换液,当细胞生长密度>80%时(4-5 d)胰酶消化传代。

1.2.2 细胞活力实验

用胰酶消化培养皿中处于对数生长期的细胞为单细胞悬液,以每孔1.0×104～1.5×104的密度接种于96孔板,每孔培养液体积为100μL,待细胞贴壁后吸出培养液 ,分别加入含 0(对照组)、1、2、4、8、16和32μmol/L浓度的NaAsO2培养液,继续分别培养24 h和48 h。每组设6个平行孔,以MTT法在酶联免疫检测仪上检测各组在490 nm波长的吸光度值,以对照组吸光度值为参照,其他各浓度组与其比较,计算各组的细胞抑制率。此实验重复3次。

1.2.3 NIT-1细胞Insulin mRNA表达的RT-PCR半定量检测

不同剂量 NaAsO2作用后,提取总 RNA,将mRNA逆转录为cDNA后行PCR。各基因引物序列及反应条件如下:

PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃1 min,60℃30 s,72℃1 min,30个循环;72℃延伸5 min。PCR产物分析经琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统观察,照相。对目的片段和β-actin内参片段相应条带进行光密度值检测。

靶基因mRNA相对表达量=靶基因光密度值/β-actin光密度值。

1.2.4 统计分析

2 结果

2.1 MTT结果

NaAsO2对NIT-1细胞增殖抑制率随浓度和时间变化见图1。

结果显示NaAsO2对细胞增殖的抑制作用呈浓度和时间依赖性,当NaAsO2浓度小于2μmol/L的时候促进 NIT-1细胞增殖(P>0.05)。当NaAsO2浓度大于4μmol/L时抑制细胞增殖(P<0.01),细胞增殖抑制率随NaAsO2浓度的增加及作用时间的延长而增加(P<0.01)。

图1 不同浓度NaAsO2作用NIT-1细胞生长抑制曲线(±S,n=3)Fig.1 The inhibition ratio of NIT-1 insulinoma cells treated with NaAsO2

2.2 NaAsO2对NIT-1细胞 Insulin基因转录水平的影响

用 RT-PCR方法检测不同浓度NaAsO2处理后的NIT-1细胞 Insulin mRNA的表达,可见512 bp处的β-actin基因(cDNA)条带和210 bp处的Insulin基因(cDNA)条带(图2)。

对条带进行光密度分析,测得 Insulin mRNA相对表达量,NaAsO2作用24 h,各剂量组 Insulin mRNA表达降低,其中8μmol/L组与对照组比差异有统计学意义;NaAsO2作用48 h,各剂量组Insulin mRNA表达降低,其中4μmol/L组和8μmol/L组与对照组比差异有统计学意义(表1,图3)。

表1 不同浓度NaAsO2作用NIT-1细胞Insulin mRNA相对表达量(insulin/β-actin)±S,n=3Tab.1 Relative level of insulin mRNA expression of NIT-1 insulinoma cells

表1 不同浓度NaAsO2作用NIT-1细胞Insulin mRNA相对表达量(insulin/β-actin)±S,n=3Tab.1 Relative level of insulin mRNA expression of NIT-1 insulinoma cells

注:＊表示与对照组比较 P<0.05。

组别 24 h 48 h对照 1.2117±0.0602 1.2224±0.0913 1μmo/L 1.1546±0.0466 1.193±0.0769 4μmo/L 1.1326±0.0634 1.1143±0.0909＊8μmo/L 1.0265±0.0394＊0.9903±0.0388＊

图3 不同浓度NaAsO2作用NIT-1细胞Insulin mRNA表达的影响Fig.3 The effect of NaAsO2on insulin mRNA expression of NIT-1 insulinoma cells

3 讨论

DM是一种慢性疾病,已成为世界范围的严重危害人们健康的疾病,因此预防和控制DM已成为世界各国亟待解决的问题。近年来流行病调查资料已显示,长期接触砷可以导致DM的发生[6-10],砷也可能是DM发生发展的另一重要因素之一。

目前大家公认的DM的病因与机制:DM不是唯一病因所致的单一疾病,而是复合病因的综合症,与遗传、自身免疫及环境因素有关。从胰岛β细胞合成和分泌Insulin,经血液循环到达体内各组织器官的靶细胞,与特异受体结合,引发细胞内的物质代谢的效应,在这个过程中任何一个环节发生变异,均可导致DM。而砷引发DM的作用环节和机制的资料报导甚少,砷作用的具体机制目前仍未阐明,砷可以通过多种途径参与影响细胞增殖及基因表达等。本实验发现低浓度砷对胰岛β细胞功能产生一定程度的影响,MTT结果显示NaAsO2抑制NIT-1细胞的增殖呈浓度和时间依赖性,选择在NaAsO2不引起胰岛细胞明显死亡的浓度和时间范围内进一步研究发现,NaAsO2可以抑制胰岛β细胞 Insulin mRNA表达并具有时间剂量依赖性,而 Insulin合成与Insulin mRNA表达密切相关。因此,砷可以通过影响胰岛β细胞Insulin mRNA的表达,进而影响Insulin合成功能。这也可能是砷引发DM的机制之一,其具体作用机制以及是否还影响 Insulin分泌有待继续研究。

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The Effect of NaAsO2on Proliferation and Insulin mRNA Expression of NIT-1 Insulinoma Cells

WANG Rui,ZHANG Bingyin,LI Li,LI Yuanyuan,YANG Yuanyuan,MU Xiaoling
(Medicine College,Shihezi University/Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases,Shihezi 832002,China)

R329.1

A

1007-7383(2010)04-0457-04

2009-10-11

王瑞(1979-),男,硕士生,专业方向为砷与糖尿病关系的研究。

慕晓玲(1962-),女,教授,从事砷与糖尿病关系的研究;e-mail:xiaolingmr@163.com。