纤维素酶和果胶酶对番茄红素提取的影响

袁春龙，张 金

(1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100)

纤维素酶和果胶酶对番茄红素提取的影响

袁春龙1,2，张 金1

(1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100)

以番茄组织为材料，用含体积分数2%二氯甲烷的石油醚为提取溶剂，研究添加果胶酶和纤维素酶提取番茄红素的实验。结果表明，果胶酶和纤维素酶混合使用比单一酶的提取效率高，且果胶酶的提取效果比纤维素酶要好。在果胶酶和纤维素酶混合质量比为2:1时，提取番茄红素的最佳条件为A3B2C2D4，即混合酶用量0.6g/100g、酶解温度35℃、pH5.0、酶解时间5h，然后2%二氯甲烷的石油醚提取20min，4000r/min离心10min。因此，添加果胶酶和纤维素酶，用2%二氯甲烷的石油醚提取，可以提高番茄红素的提取率。

番茄红素；纤维素酶；果胶酶

番茄红素(lycopene)是一种在动植物体中广泛分布的类胡萝卜素(carotenoids)，呈红色，因最先发现于番茄中而得名。过去番茄红素由于不具备VA的活性，而被认为是一种不重要的类胡萝卜素，一直未被重视。然而，近年来，随着人们健康意识的提高，以及新的科学技术的发展，研究人员发现番茄红素具有抗氧化、消除人体自由基、防癌、抗癌[1-3]、抗衰老、预防心血管疾病[4-5]、防辐射及紫外线、提高男性生育能力等多种生理功能，其抗氧化性在类胡萝卜素中最强，防癌、抗癌的效果明显优于α-和β-胡萝卜素(carotene)，是一种很有发展前途的功能性天然色素[5-6]。

目前，我国番茄红素的生产和研究均处于起步阶段，其生产工艺上主要有浸提法[7-8]、酶反应法[9]和超临界CO2流体萃取法[10-12]、高速逆流色谱法、微波辐射萃取法及利用工程菌株发酵法生产番茄红素[13-14]。浸提法常用有机溶剂乙酸乙酯、氯仿等；酶反应法采用外加纤维素酶等来提高番茄红素的提取速度和提取量；超临界CO2流体萃取法具有能耗低、无毒、易回收、可低温处理等优点，得到的番茄红素无异味，无溶剂残留，提取番茄红素的收率可达90%以上，但成本过高，不适合大规模生产；高速逆流色谱法、微波辐射萃取法及利用工程菌株发酵法，仍处在实验研究阶段。本实验通过外源添加果胶酶、纤维素酶，研究混合酶用量及其比例、酶促反应的温度、pH值及酶解时间对番茄红素提取率的影响，并通过正交试验获得提取番茄红素的最佳工艺，为合理充分利用番茄资源，提取番茄红素提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

番茄(新鲜、成熟) 杨凌某农贸市场。

果胶酶(酶活力≥10万U/g) 天津市酶制剂厂；纤维素酶(酶活力≥8万U/g) 上海东风生化技术有限公司；85%磷酸、96%氢氧化钠、99%二氯甲烷、石油醚(沸程60～90℃)(均为分析纯) 西安化学试剂厂。

高速组织捣碎机 深圳泰康达科技有限公司；PH-29A型酸度计 北京赛多利斯仪器系统有限公司；恒温电热水浴锅 北京长风仪器仪表厂；SP2102UV紫外-可见光光度计 上海江星仪器有限公司；离心机 上海安亭科学仪器厂；恒温水浴锅 北京泰克仪器公司。

1.2 方法

新鲜番茄清洗并称其质量，在100℃左右的水浴中热烫去皮，然后用高速组织捣碎机打浆，打到无大的片状、团状物为止。在85℃的水浴锅中钝化20min，并且不时用玻璃棒搅拌，然后冷却至室温备用。

1.2.1 果胶酶和纤维素酶单独使用提取番茄红素的实验

称取20g钝化后的番茄汁，分别装在5个250mL的带塞三角瓶中，加入果胶酶0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/100g，40℃酶解4h，冷却至室温，再用含体积分数2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上层油相过滤后4000r/min离心10min，上清液在波长472nm处测定吸光度，以确定果胶酶的最佳用量。再按上述方法确定纤维素酶的最佳用量。

1.2.2 果胶酶和纤维素酶混合比例的确定

称取20g钝化后的番茄汁，分别装在5个250mL的带塞三角瓶中，加入果胶酶和纤维素酶质量比3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，总酶量为0.8g/100g，于40℃酶解4h，冷却至室温，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上层油相过滤后4000r/min离心10min，上清液在波长472nm处测其吸光度，以确定混合酶的最佳比例。

1.2.3 果胶酶和纤维素酶混合用量的确定

称取20g钝化后番茄汁，分别装在5个250mL的带塞三角瓶中，在最佳比例下，分别加入总酶量0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/100g，于40℃酶解4h，冷却至室温，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上层油相过滤后4000r/min离心10min，上清液在波长472nm处测其吸光度，确定最佳混合酶用量。

1.2.4 果胶酶和纤维素酶混合使用时pH值的确定

称取20g钝化后的番茄汁，分别装在5个250mL的带塞三角瓶中，调整pH值依次为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，在一定的混合酶最佳比及其用量，于40℃酶解4h，冷却至室温，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上层油相过滤后4000r/min离心10min，上清液在波长472nm处测其吸光度，确定最佳pH值。

1.2.5 果胶酶和纤维素酶混合使用时酶解时间的确定

称取20g钝化后的番茄汁，分别装在6个250mL的带塞三角瓶中，加入一定的混合酶最佳比例及其用量，于40℃酶解2、3、4、5、6、7h，冷却至室温，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上层油相过滤后4000r/min离心10min，上清液在波长472nm处测其吸光度，确定酶解的最佳时间。

1.2.6 果胶酶和纤维素酶混合使用时酶解温度的确定

称取20g钝化后的番茄汁，分别装在4个250mL的带塞三角瓶中，加入一定的混合酶最佳比例及其用量，分别在30、35、40、45℃条件下酶解4h，冷却至室温，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上层油相过滤后4000r/min离心10min，上清液在波长472nm处测其吸光度，确定酶解的最佳温度。

1.2.7 果胶酶和纤维素酶酶解最佳提取条件的确定

在单因素试验基础上，确定果胶酶和纤维素酶的质量比为2:1，通过混合酶用量、酶解温度、酶解pH值、酶解时间4个主要因素，进行四因素四水平的L16(44)正交试验设计(表1)，以确定酶解提取番茄红素的最佳条件。

表1 果胶酶和纤维素酶提取番茄红素的正交试验Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.3 数据处理

所有实验均重复3次，数据取平均值，采用Excel处理。

2 结果与分析

2.1 果胶酶、纤维素酶单独用量对番茄红素提取的影响

由图1可见，单独使用果胶酶酶解提取番茄红素时，随着酶用量的增多，吸光度逐渐增大，说明番茄红素的提取量逐渐增加，果胶酶最佳用量是0.8g/100g；而纤维素酶随着酶用量的增加，提取量先升高，而后逐渐下降，最佳用量是0.4g/100g，而且果胶酶的效果比纤维素酶好。

2.2 果胶酶和纤维素酶混合比例对番茄红素提取的影响

图4 pH值对番茄红素提取的影响Fig.4 Effect of pH on lycopene extraction

图2 果胶酶和纤维素酶混合比例的确定Fig.2 Effect of pectinase/cellulase ratio on lyopene extraction

由图2可知，随着果胶酶和纤维素酶的比例的逐渐降低，吸光度也逐渐下降，比例越低，其吸光度亦越低，说明果胶酶对番茄红素的提取作用明显；二者的比例在3:1、2:1时的吸光度相差不多，从成本上考虑，选择最佳比例为2:1。

2.3 混合酶用量对番茄红素提取的影响

图3 混合酶用量对番茄红素提取的影响Fig.3 Effect of total dosage of pectinase and cellulase on lycopene extraction

由图3可见，果胶酶和纤维素酶以2:1的比例混合均匀，随着混合酶总量的增多，吸光度缓慢升高，至1.0g/100g达到最大，但和0.6g/100g相比，只相差0.013，故选择最佳用量为0.6g/100g。

2.4 pH值对番茄红素提取的影响

由图4可知，在果胶酶和纤维素酶最佳比例2:1，用量0.6g/100g，40℃酶解4h，随着提取液pH值的升高，吸光度先上升后下降，当pH5.0时，吸光度最大，说明番茄红素的提取量最高，故选择最佳pH值为5.0。

2.5 酶解时间对番茄红素提取的影响

图5 酶解时间对番茄红素提取的影响Fig.5 Effect of hydrolysis time on lycopene extraction

由图5可知，果胶酶和纤维素酶的比例2:1，用量0.6g/100g，在40℃、pH5.0条件下提取番茄红素，随着酶作用时间的延长，吸光度迅速增加，当达到4h时，再延长酶解时间，其吸光度趋于稳定，所以酶解时间确定为4h。

2.6 酶解温度对番茄红素提取的影响

图6 酶解温度对番茄红素提取的影响Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on lycopene extraction

由图6可见，果胶酶和纤维素酶的比例2:1，用量0.6g/100g，pH5.0，酶解4h，随着酶解温度的升高，吸光度先升高再下降，在35℃时达到最大，故选择酶解温度为35℃。

2.7 果胶酶和纤维素酶提取番茄红素的最佳工艺

根据表2正交试验结果可知，果胶酶和纤维素酶以2:1混合，提取番茄红素的最佳工艺组合是A3B2C2D4，即混合酶用量0.6g/100g、酶解温度35℃、pH5.0、酶解5h，然后用含2%二氯甲烷的石油醚提取20min，4000r/min离心10min，所得的提取液番茄红素最高。由表3方差分析结果表明：影响番茄红素提取效果的顺序大小依次为B＞D＞C＞A，即影响最大的是酶解温度，其次是酶解时间和pH值，最小的是果胶酶和纤维素酶的酶用量。

表2 果胶酶和纤维素酶提取番茄红素的正交试验结果Table 2 Orthogonal array design arrangement and experimental results

表3 显著性分析表Table 3 Results of significance tests

3 结论与讨论

番茄红素是一种开链式的不饱和胡萝卜素，由8个异戊二烯单体组成，分子式为C40H56，有顺式和反式两种异构体，在植物中存在的番茄红素几乎都是反式的，而在动物体内存在的番茄红素，顺式异构体占的比例较大。顺式异构体比反式更容易被吸收，加热可以使反式的番茄红素转变成顺式的，以便利于被吸收利用。由于番茄红素是一种脂溶性色素，不易渗透穿过细胞壁和细胞膜，很难从细胞壁中溶出，应用酶解破坏细胞壁可以有效地促使各种化学物质从植物组织中释放出来，包括油脂类[16]、非挥发性葡萄香气物质[17]、胡萝卜素[18]等物质，提高其提取率。Lavecchia等[19]应用果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等处理，在40℃酶解1h，然后加入有机溶剂(丙酮、乙醇、乙酸乙酯、环己烷)提取3h，提取率达到77%～98%，而对照只需3%～30%。Choudhari等[15]应用果胶酶和纤维素酶酶解方法提取番茄红素，认为果胶酶的效果比纤维素酶好的多。本实验应用含2%二氯甲烷的石油醚为提取溶剂，研究果胶酶和纤维素酶单独使用和复合使用对番茄红素提取的影响，结果显示果胶酶和纤维素酶混合使用比单一酶的提取效率高，而且果胶酶的提取效果比纤维素酶要好。在果胶酶和纤维素酶质量比为2:1时，混合使用这两种酶提取番茄红素的最佳条件为混合酶用量0.6g/100g、酶解温度35℃、pH5.0、酶解时间5h，然后用2%二氯甲烷的石油醚提取20min，4000r/min离心10min。影响番茄红素提取效果最大的是酶解温度，其次是酶解时间和pH值，最后是果胶酶和纤维素酶的用量。

关于混合酶用量影响最小的具体原因还不清楚，可能有以下几个方面：1)酶的加入仅仅是为了破坏细胞壁，促进番茄红素的溶出，一般认为，细胞壁破坏越严重，番茄红素的溶出就越容易。但并不一定提取的番茄红素就越高，它还与其提取的溶剂、提取温度、提取次数、提取时间等因素有关[19]；2)在酶促反应中，当底物浓度远远大于酶浓度时，随着酶添加量的增加，反应速度加快；当底物全部被酶结合，酶用量再大，反应速度不再变化；所以，当酶用量过大时，提取率与酶用量没有相关性；3)酶的活力不同，对番茄红素提取的影响也不同。不同的厂家，酶的纯度、活性大小是有所差别的；4)不同的番茄组织，酶用量也不相同。对于整个番茄果实，用4～6g/100g纤维素酶和0.25～4g/100g果胶酶处理，结果显示6g/100g的纤维素酶和0.5g/100g的果胶酶处理获得的番茄红素最高，分别为96.3μg/g和90.6μg/g；3g/100g的纤维素酶处理果皮，番茄红素的产量最佳为424μg/g，而2g/100g的果胶酶处理最好，为712μg/g[15]；5)当酶的添加量比较少时，影响酶促反应的因素可能就是酶促反应的温度、时间和pH值。此外，为了打浆方便，本实验对果实进行了去皮处理，由于番茄皮中含有较多的番茄红素[20]，必将影响番茄红素的提取；另外本实验只用提取液吸光度的大小反映提取效果，没有具体含量和提取率，这是本研究的不足之处。

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Synergic Effects of Cellulase and Pectinase on Extraction of Lycopene from Tomato

YUAN Chun-long1,2，ZHANG Jin1
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

In the extraction of lycopene from tomato, petroleum ether containing 2% (V/V) dichloromethane was used as extraction solvent. Lycopene extraction was investigated with respect to the effects of respective and synergic hydrolysis of tomato by cellulase and pectinase. The results indicated that a higher extraction yield of lycopene was obtained when pectinase,instead of cellulase was used for hydrolyzing tomato. More lycopene was extracted from tomato using both of the enzymes than using pectinase alone. The optimal parameters for extracting lycopene using both of the enzymes were determined as follows:pectinase/cellulase ratio 2:1, their total dosage 0.6 g/100 g, and pH 5.0 for 5 h hydrolysis at 35 ℃, followed by extraction for 20 min using the above extraction solvent and centrifugation at 4000 r/min for 10 min.

lycopene；cellulase；pectinase

TS255.4

A

1002-6630(2010)13-0100-05

2009-12-09

杨凌农业科技开发基金项目(2004TA21)

袁春龙(1969—)，男，副教授，博士，研究方向为葡萄与葡萄酒功能性成分。E-mail：yuanchunlong@hotmail.com