基因工程在黄瓜育种中的应用

盛 强 史湘华

（辽宁省农业技术学校 110161）

黄瓜是我国主要的蔬菜作物。近年来，随着我国黄瓜栽培面积的逐渐扩大，黄瓜连作障碍和种性退化现象严重。因此，新品种的选育就成为黄瓜可持续生产的关键。黄瓜品种的选育工作始于上世纪50年代末；60年代黄瓜育种工作的重点是选育抗病育种，人们利用传统的常规选育方法育成了津研系列黄瓜；70年代在常规品种选育的基础上进行了黄瓜杂种一代优势利用的研究；到了80年代黄瓜育种不仅在抗病性，而且在早熟性、丰产性和品质等方面也有较大提高。

传统的育种方法是通过杂交、自交和回交等手段培育新品种。育出一个新品种通常需要5～8年，周期长、成效低，并且受种质资源的限制，可供利用的性状资源差异越来越小，所以仅靠现有的种质资源和常规育种方法很难使新品种在抗病性、品质方面有较大突破。随着细胞工程和基因工程技术等一系列现代生物技术的建立，生物技术已成为当今世界发展最快、最活跃的高新技术。20世纪90年代，基因工程技术开始应用于选育黄瓜新品种，现已呈现出良好的发展前景。基因工程技术是在分子水平上对基因进行直接操作，可在优良的遗传背景下只改变个别性状而不影响其它性状，实现定向改良植物遗传性状，提高育种的目的性和可操作性。利用基因工程技术选育黄瓜品种，在一定程度上解决了黄瓜种质资源有限、性状资源差异不明显、培育新品种年限长的难题。在黄瓜育种上，应用较多的基因工程技术有分子标记技术和转基因技术。

1 分子标记技术

分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的遗传标记形式。同前几种标记相比，分子标记直接以DNA的形式表现，数量多且多态性高。许多分子标记表现为显性、共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息供育种实践利用。1980年，Bostein和White等首次提出用RFLP作为遗传标记构建遗传连锁图谱之后，相继出现了20多种DNA分子标记方法，它们的应用已覆盖了生命科学的许多领域。按其技术原理，分子标记可分为3大类：第1类是以分子杂交为基础的标记技术，主要是RFLP；第2 类是以 PCR（Polymerase Chain Reaction）反应为基础的一系列分子标记技术，如RAPD（Random Amplified PolymorphicdNA）、SSR（Simple Sequence Repeat）、SCAR （Sequence Characterized Amplified Regions）、STS（Sequence Tagged Site）等；第 3 类是以酶切和PCR为基础的分子标记技术，如AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）、CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）。 目前应用较多的是RFLP，RAPD，AFLP及 SSR。RFLP是指不同生物的DNA经限制性内切酶消化后，通过分子杂交检测酶切同源片段大小上的差异。这种差异是DNA分子碱基突变引起的限制性内切酶酶切位点的缺失或增加，以及DNA分子片段插入、重复、缺失等行为造成的。RFLP标记一般为共显性，但RFLP操作较复杂、费用较高。RAPD是一种运用随机引物扩增基因组，寻找多态性DNA片段作为分子标记的新技术。RAPD技术建立在PCR技术基础之上，利用一系列不同的寡聚核苷酸为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。RAPD技术程序简单、快捷、成本低。AFLP标记的要点是选择性地扩增基因组DNA的限制性酶切片断。首先用两个（也可一个或多个）限制性内切酶消化基因组DNA，再用与这两个酶酶切末端配对的两个双链人工接头连接限制性酶切的片段作为扩增反应模板，其实质是RFLP与PCR结合的一种技术。AFLP多态性强、稳定性高、重复性好。该技术的缺点是通常需用同位素，危害人体健康，成本较高。SSR也叫微卫星DNA，是指DNA分子中2～4个碱基组成的简单重复序列，其分布遍及人类和动植物的所有染色体及染色体各个片段。不同品种间其重复单位数有极高的变异。根据其两端特异序列来设计引物，通过PCR扩增基因组中的重复序列位点，分析基因组的多态性。该标记具有RAPD标记的所有优点，且多态性更丰富，同时又克服了RAPD缺点，具有较高的稳定性。但要获得SSR引物需要进行大量克隆、测序和杂交验证工作。

分子标记技术在黄瓜上的应用没有十字花科、茄科作物普遍，但在黄瓜遗传及育种的研究中起着重要作用。遗传图谱是植物遗传育种及分子克隆等许多应用研究的理论依据和基础，传统的遗传标记技术标记数目少，难以形成一个较为完整的连锁图。RFLP自发明后就被广泛用于植物的遗传作图，而RAPD标记多态性丰富，操作简单，用于构建遗传图谱比RFLP更为快速、经济。对那些已建立了RFLP图谱的植物，可以利用RAPD技术找到新的标记补充到RFLP图谱中。AFLP虽然建立的时间较短，但因多态性信息非常丰富，同时重演性和可信度又比RAPD高得多，是构建饱和图谱的有力工具。目前，通过RFLP、RAPD、SCAR和STS标记技术已构建了黄瓜等20种蔬菜遗传图谱，其中番茄、马铃薯、甘蓝等蔬菜作物的图谱已趋于饱和。

Staub等利用分子标记技术将来源于国家植物种质系统 （NPGS）的922份黄瓜种质材料与118份栽培黄瓜材料进行了分析比较，发现栽培材料的遗传背景十分狭窄，而前者的遗传多样性较丰富。借助分子标记技术，可以将来源于NPGS黄瓜中的基因通过回交引入栽培黄瓜，进行品种改良。

利用分子标记技术进行蔬菜品种鉴定不受环境、取材部位、时间等因素影响，而且信息量大，可以准确、快速区分出形态标记难以鉴别的细微差异。品种鉴定首先需要构建品种的标准DNA指纹图谱，将需要鉴定的品种的指纹与标准指纹进行比较分析，即可知道品种的纯度和真伪。

由于受环境因素影响很大，传统的基因定位方法进行基因标记所得的遗传图谱可靠性较低。而利用分子标记技术可以提高遗传分析的准确性和选种、育种的有效性。国艳梅通过AFLP技术对控制黄瓜苦味的基因bi进行了引物筛选，得到了两个有效引物。Hallden找到了与抗病基因紧密连锁的PCR标记。张海英用RAPD技术找到了欧洲温室类型黄瓜材料的特征谱带。

目前，利用分子标记技术在黄瓜遗传图谱构建、种质资源、基因定位、抗病育种和品种的纯度鉴定等方面研究取得了一定的进展。如何利用分子标记技术挖掘和利用黄瓜的种质资源中的优良基因是将来分子生物学在黄瓜品种改良上应用研究的重点。

2 转基因技术

基因工程是在重组DNA技术上发展起来的一门新技术，它是以分子遗传学理论为基础，综合了分子生物学、微生物学和植物组织培养等现代技术和方法。转基因技术是指一种或几种生物体的基因或载体先在体外按照人们的设计拼接，然后转入另外一种生物体内，使之依照人们的意愿遗传，表达出人们所希望的新性状。即将外源目的基因经过或不经过修改，通过生物、物理或化学的方法导入另外一种生物体内，以改良其性状，得到优质、高产、抗病虫及抗逆性强的新品种。

目前转入外源基因的方法主要包括根癌农杆菌介导的外源基因转移法和外源基因直接导入法，后者又包括EFG法、电激法、生物射弹法（基因枪法）、花粉管道法、微注射法等等。EFG法、电激法、脂质体法均以原生质为受体，操作需格外精细；基因枪法虽然导入效率高，适用对象广，但因设备较贵，应用受到限制；花粉管通道法不需要精密仪器，操作相对简易，可在大田条件下运用，较适合我国国情，发展前景较好。

到目前为止，已进行转基因并获得转基因植株的蔬菜有番茄、马铃薯、胡萝卜、芹菜、菠菜、生菜、甘蓝、花椰菜、大白菜、黄瓜、西葫芦、豇豆、茄子、辣椒、石刁柏等，所改良的农艺性状包括抗虫、抗病、抗除草剂、延熟保鲜及其它品质。黄瓜体细胞再生与转基因技术可将外源的抗病、抗虫、抗逆及特有品质等有效基因导入植物体，从而产生具有新性状的植株，培育出新的抗病、抗虫、抗逆等优良品种。转基因黄瓜不仅可以保留原来优良的丰产性、商品性，而且获得了新的抗病性或抗除草剂等特性，可以大幅度节约生产成本，提高生产效率。目前，已经发现黄瓜转水稻几丁质酶基因植株可以提高对灰霉病的抗性，还可以产生对CMV的抗性。病毒病是黄瓜最主要的病害之一，近年来已实现了把抗病毒病基因转入到黄瓜体内。鲽鱼科的抗冻基因转入黄瓜中，可提高黄瓜抗冷性，为发展冷冻保鲜蔬菜提供了条件。天津科润黄瓜研究所正在利用建立的黄瓜转基因技术，开展黄瓜耐盐基因、抗除草剂基因的转化研究，并已经取得阶段性成果。

转基因工程在黄瓜遗传育种、品质改良上的应用前景是十分乐观，最近十几年来已取得很大进展，转基因蔬菜成果已经在生产上得到应用。另外，基因工程带来明显经济效益的同时，也有可能产生一些潜在的负面影响，比如转基因产品的食用安全性以及是否可能带来生态破坏等。虽然我们已经建立了相关法规和条例，并对产品安全性进行了评估和监控，但仍要加强管理和监督，加大宣传力度，使转基因蔬菜有更加广阔的发展前景。

目前，生物技术在黄瓜新品种选育上还没有得到普遍应用，有些技术还处于研究阶段，如利用分子标记进行系谱分析和定位，品系、品种和杂种的鉴定及品质、抗病性鉴定等还只是作为黄瓜育种的辅助手段。虽然转基因工程在抗性、品质改良方面有一定的应用，但仍然存在着许多不容忽视的问题，如转化率低，结果不稳定等。因此，我们在加强转基因育种研究的同时要解决好基因工程与常规育种的关系，使其尽快转化为生产力。我们相信，生物技术必将对黄瓜育种方法产生深远的影响，为蔬菜产业及整个农业的发展做出越来越大的贡献。