正交试验法优化制备用于小分子物质分离的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯)型整体柱

马 伟, 徐环昕,2, 刘坐镇,2＊, 宁方红,2

(1.华东理工大学生物反应器国家重点实验室,上海200237;2.上海华震科技有限公司,上海200237)

正交试验法优化制备用于小分子物质分离的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯)型整体柱

马 伟1, 徐环昕1,2, 刘坐镇1,2＊, 宁方红1,2

(1.华东理工大学生物反应器国家重点实验室,上海200237;2.上海华震科技有限公司,上海200237)

以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体,二乙烯基苯(DVB)为交联剂,以环己醇和正十二醇为致孔剂,过氧化苯甲酰(BPO)为引发剂,直接以50mm×4.6mm色谱柱为模具,通过原位聚合制备聚(GMA-DVB)型整体柱。以GMA和DVB的体积比、环己醇和十二醇的体积比以及BPO占聚合物的质量分数为三因素,以分离苯和乙苯等小分子物质时的半峰宽分离度(R1/2)为考察指标,进行三因素三水平的正交试验,通过测定整体柱的比表面积、孔径和孔容分布对其进行表征。结果表明,制备整体柱的最优配方为V(GMA):V(DVB)∶V(环己醇)∶V(正十二醇)=0.825∶0.825∶1.32∶2.03,BPO的质量分数为0.7%。应用所制备的整体柱分离苯和乙苯等小分子物质,理论塔板数达到37 000塔板/m,R1/2值达到7.14,完全达到基线分离,分离时间小于10m in。该方法制备整体柱的重复性好,柱效较高,基本满足商品化要求。

聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯);整体柱;制备;高效液相色谱;小分子物质

Abstract:Amonolithic column of macro porouspoly(glycidyl methacrylate-divinyl benzene)(poly(GMA-DVB))has been p repared by free radical polym erization within the confines of a Chromatographic stainless steel tube(50mm×4.6mm).For the best separation and low back pressure,orthogonal experiments were carried out with V(cyclohexanol)∶V(dodecanol),V(GMA)∶V(DVB)and BPO dosage as the three main factors.The characteristic feature of the column,including specific surface area,pore volume as well as pore diameter distribution,was studied by scanning electron microscopy(SEM),mercury intrusion porosimetry analysis and B ET analysis.The obtained optimump reparation conditions were that the volume ratio of GMA,DVB,cyclohexanol and dodecanol was0.825∶0.825∶1.32∶2.03and the B PO dosage was 0.7%(mass percentage),then it was heated at70℃for24h.U sing this m onolithic colum n,benzene and ethylbenzene and a drug of oxiracetam can be w ell separated on a high performance liquid Chromatographic(HPLC)system equipped with a ultraviolet(UV)detector at254 nm.A solution of acetonitrile-water(50∶50,v/v)for the separation of benzene and ethylbenzene,and acetonitrile-water(80∶20,v/v)for the separation of oxiracetam were used as mobile phases at a flow rate of1mL/m in.The theoretical p late number was37 000p lates/m and the resolution of peak width at half height(R1/2)was7.14.The separation time was less than10m in.The monolithic column prepared by this method is reproducible and has high column efficiency.It is an economical method to prepare monolithic column,which can be ap-plied to separate small molecules.

Key words:poly(glycidyl methacrylate-divinylbenzene);monolithic column;p reparation;high perform ance liquid Chromatography(HPLC);small molecular

整体柱(monolithic column),又称棒柱(rod)、连续床(continuous bed)、无塞柱(fritless colum n),被人们称为继多聚糖、交联与涂渍、单分散之后的第四代分离介质[1]。整体柱是利用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相。它具有制备方法简单、内部结构均匀、重现性好、有较高的柱效和可进行快速分离等优点,是近年来发展较快的一种色谱柱。整体柱主要分为有机聚合物整体柱和无机硅胶整体柱。有机聚合物整体柱由单体、引发剂、致孔剂等混合物通过原位聚合制备而成。由于整体柱在制备时选材范围广,因而其具有不同的选择性,适用的pH范围宽。目前已在反相高效液相色谱(HPLC)[2-5]、疏水作用色谱[6,7]、离子交换色谱[8,9]、亲和色谱[10]等中获得了广泛的应用。

聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类整体柱表面具有环氧结构,可以进一步修饰使其具有不同的选择性,而且可以在pH2～12范围内使用,扩大了应用范围。例如,以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体的聚合物易于引入离子基团而制备离子交换色谱柱[8,11,12],或者用β-环糊精对GMA进行修饰,从而制备手性色谱柱[13,14]。我们前期制备有机聚合物整体柱分离小分子的研究表明使用二乙烯基苯(DVB)作为交联剂,制得的整体柱的刚性较好[15]。

基于以上分析,我们设计了以GMA为单体,DVB为交联剂,过氧化苯甲酰(BPO)为引发剂,以GMA和DVB的体积比、环己醇和十二醇的体积比以及B PO占聚合物的质量分数为三因素的正交试验优化制备聚(GMA-DVB)整体柱的条件,并应用所制得的整体柱对一些小分子物质进行了分离和分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);Agilent1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司);KQ-100D E型数控超声波发生器(昆山超声仪器有限公司);XL30FEG型场发射扫描电镜(荷兰Royal Philips电子公司);ASAP2010型全自动物理与化学吸附仪、Autopore9500全自动压汞仪(美国麦克仪器公司)。

GMA(纯度为99.9%,日本三菱化学株式会社);DVB(含量为80%,淄博东大化工股份有限公司,使用前经减压蒸馏,无水硫酸镁脱水后低温保存);过氧化苯甲酰(B PO,泰兴市梅兰化工有限公司);环己醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);十二醇(分析纯,上海永华化学试剂有限公司);苯和乙苯(分析纯,上海菲达工贸有限公司);乙腈(色谱纯,美国Honeyw ell公司);奥拉西坦(实验室自制,晶体);其他试剂均为分析纯或色谱纯。

1.2 实验方法

1.2.1 聚(GMA-DVB)型整体柱的制备

以GMA为单体,DVB为交联剂,环己醇和十二醇为致孔剂,B PO为引发剂,按V(GMA)∶V(DVB)∶V(环己醇)∶V(正十二醇)=0.825∶0.825∶1.32∶2.03的比例进行配料,按7.0%(质量分数)的比例加入BPO。将BPO溶解到由GMA、DVB、环己醇和十二醇组成的混合溶液中,超声15 m in。将规格为50mm×4.6mm的不锈钢色谱柱管的一端密封,另一端用连接头连接一根空的色谱柱管,加入上述混合溶液,超声15m in,以除掉溶液中以及溶液柱管壁之间的气体。然后将另一端与一个加压装置相连,垂直放入70℃恒温油浴中反应24h。整体柱制备装置如图1所示。

图1 整体柱制备装置图Fig.1 Se tup for p repa ra tion of m onolithic colum n

在整个反应过程中,通过氩气对反应系统施加0.18M Pa的恒定压力。反应结束后,除去色谱柱一端封头和另一端连接头,用刀片切平,更换柱接头后将其连接到HPLC系统,用甲醇以0.8mL/m in的流速冲洗30m in,除去环己醇、十二醇以及其他反应后残留的可溶物质,得到聚(GMA-DVB)整体柱。

1.2.2 聚(GMA-DVB)型整体柱结构的表征

利用HPLC系统将柱管中的整体柱打出,于真空下干燥。用压汞法及B ET法分别测定整体柱的大孔和微孔孔径分布、孔容及比表面积,扫描电子显微镜表征整体柱的微观特征。

1.2.3 整体柱分离小分子的色谱条件

分离苯和乙苯:流动相为乙腈-水(50∶50,v/v),进样量10μL,检测波长254nm,操作温度30℃。

分离奥拉西坦:流动相为乙腈-水(80∶20,v/v),进样量10μL,检测波长254nm,操作温度25℃。

1.2.4 理论塔板的计算

其中,N为理论塔板数,H为理论塔板高度,tR(m in)为保留时间,W1/2(m in)为半峰宽,L为柱长。

1.2.5 色谱柱半峰宽分离度(R1/2)的测定

分离度(R)是把柱效率和溶剂效率结合在一起的参数,是标识色谱柱在一定的色谱条件下对混合物综合分离能力的指标。R1/2和R相似,只是用W1/2代替峰宽(W),用公式(3)表示。在多数色谱图中,半峰宽比峰宽更容易得到准确的数据。

2 结果与讨论

2.1 正交试验

在单因素实验的操作和分析基础上,本文采取各因素相互独立的正交试验L9(34)进一步优化各参数,最终得到更好的整体柱制备条件。该正交试验以整体柱分离苯和乙苯的R1/2为响应指标,考察了单体GMA和交联剂DVB的体积比(因素A)、致孔剂中环己醇和十二醇的体积比(因素B)以及引发剂的用量(质量分数,因素C)3个因素,每个因素设置3个水平,B lank列是实验误差列(见表1)。

表1 正交试验设计及结果的直观分析Table1 Design and Visual Analysis of the orthogonal experiments

2.1.1 直观分析

正交试验直观分析结果见表1。从表1的直观分析结果可以看出,3个因素对整体柱分离苯和乙苯的R1/2的影响主次顺序为B>A>C,即致孔剂中环己醇和十二醇的体积比是影响整体柱分离苯和乙苯效果的主要因素,其次为单体GMA和交联剂DVB的体积比,而引发剂的量的极差比空白列的极差小,可以看成是误差引起的,所以在方差分析中把C看成是误差项。

2.1.2 方差分析

正交试验方差分析结果见表2,从F分布表中查出临界值F0.05(2,4)=6.94,F0.01(2,4)=18.00,F0.05(2,4)

表2 正交试验方差分析Table2 Variance analysis of the orthogonal experiments

2.1.3 验证试验

将正交试验得到的制备整体柱的最优配方(V(GMA)∶V(DVB)∶V(环己醇)∶V(正十二醇)=0.825∶0.825∶1.32∶2.03,BPO占聚合物质量分数为0.7%)与表1中的试验3(V(GMA)∶V(DVB)∶V(环己醇)∶V(正十二醇)=0.825∶0.825∶1.34∶2.01,BPO占聚合物质量分数为0.7%)进行比较,结果见表3,从表3中可以看出,由正交试验计算出的最优条件制备的整体柱,R1/2达到7.14,比表1中的试验3的分离度高,且相同条件不同批次制备的整体柱的R1/2相差不大,说明制备的重复性很好。

表3 验证试验结果Table3 The resu lts of ve rifica tion exp e riment

2.2 聚(GMA-DVB)型整体柱的表征

聚(GMA-DVB)型整体柱是一种具有一定刚性、充满管空间结构的多孔整体。图2是整体柱的电镜扫描图,从中可以看到整体柱的孔径分布均匀,其中既有连续分布的小孔,也有1μm到2μm左右的贯穿孔,使整体柱的渗透性良好,也使HPLC系统在流动相的流速较高时仍能保持低的柱压。图3是采用压汞法测得的整体柱的孔径分布图,整体柱的比表面积为230m2/g,孔容为1.92mL/g。由图3可以看出,直径为100～1 000nm的中孔和大孔占总孔容的80%以上。图4是采用BET法测得的整体柱孔径分布图,从中可以看出所制备的整体柱还有一定数量的几纳米到几十纳米的小孔,这使得整体柱有较大的比表面积,从而有利于对小分子物质进行保留和分离。

图2 聚(GMA-DVB)内部结构扫描电镜图Fig.2 Scanning electron micrograph of the inner part of apoly(GMA-DVB)monolithic column

图3 压汞法测得的聚(GMA-DVB)型整体柱的孔径分布图Fig.3 Poresize distribution curve of a poly(GMA-DVB)monolithic column by mercury intrusion method

图4 B ET法测得的聚(GMA-DVB)型整体柱的孔径分布图Fig.4 Pore size distribution curve of a poly(GMADVB)monolithic column by B ET method

2.3 聚(GMA-DVB)型整体柱的应用

聚合物整体柱在分离大分子蛋白质、多肽等方面已经取得了突破性的进展,但是在分离小分子物质方面国内外却鲜有报道。

苯和乙苯是两种相对分子质量小于200的小分子物质,都含有苯环结构,两者的分子形态结构非常相似,比较有代表性,所以我们用制备的聚(GMADVB)型整体柱对苯和乙苯进行分离,以期反映该整体柱对小分子物质的分离能力。图5是聚(GMA-DVB)型整体柱对苯和乙苯的分离谱图。当流动相流速为1mL/m in时,整体柱的背压为5M Pa,在10m in以内就能完成一次分离,理论塔板数达到37 000塔板/m,R1/2值达到7.14。

奥拉西坦的化学名称为4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺,相对分子质量为158.16,是一种副作用小的治疗老年痴呆的处方药。图6是所制备的整体柱对奥拉西坦的分离图。从图6中可以看出,分析时间少于5m in,可以对奥拉西坦进行快速的定性检测。

图5 聚(GMA-DVB)型整体柱分离苯和乙苯的色谱图Fig.5 Chromatogram of separation of benzene and ethylbenzene on a poly(GMA-DVB)monolithic column

图6 聚(GMA-DVB)型整体柱分离药物奥拉西坦的色谱图Fig.6 Chrom a togram of oxirace tam drug on a poly(GMA-DVB)monolithic column.

3 结论

本文通过三因素三水平正交试验优化了聚(GMA-DVB)型整体柱的制备。制备的整体柱对小分子物质有很好的分离分析效果,柱效和分离度很高,制备的重复性很好,经济适用,基本满足商品化的要求。制备的聚(GMA-DVB)型整体柱可以进一步对其表面的环氧基团进行修饰,对今后探索手性整体柱的制备工作有很大的指导意义。制备可以分离手性对映体的整体柱将是我们今后研究工作的重点。

[1] Svec F,Peters E C,Sykora D,et al.J High Resol Chromatogr,2000,23(1):3

[2] Minakuchi H,Ishizuka N,Nakanishi K,et al.J Chromatogr A,1998,828:83

[3] Peters E C,Petro M,Svec F,et al.Anal Chem,1998,70(11):2296

[4] Zhu G J,Yang C,Zhang L H,et.al.Talanta,2006,70:2

[5] Xie J X,B i K S,Q ian X H,et al.Chinese Journal of Chromatography(谢晶鑫,毕开顺,钱小红,等.色谱),2009,27(2):186

[6] Zhang R Y,Yang G L,Xin P Y,et al.J Chromatogr A,2009,1216:2404

[7] Xie S F,Svec F,Frechet J M J.J Chromatogr A,1997,775:65

[8] Svec F,Frechet J M J.J Chromatogr A,1995,702:89

[9] Yang X R,Yang G L,Zhu T,et al.Chinese Journal of Chromatography(杨欣茹,杨更亮,朱涛,等.色谱),2009,27(2):197

[10] Amatschek K,Necina R,Hahn R,et al.J High Resol Chromatogr,2000,23(1):47

[11] Ding M Y,Zheng R,Peng H.Chinese Journal of Analytical Chemistry(丁明玉,郑睿,彭虹.分析化学),2009,37(3):395

[12] Wei YM,Huang X D,Liu R X,et al.J Sep Sci,2006,29:5

[13] Tian Y,Zhong C,Fu E Q,et.al.J Chromatogr A,2009,1216:1000

[14] Belyakova L A,Kazdobin KA,Belyakov V N.J Colloid Interface Sci,2005,283:488

[15] Yang S,Xu H X,Liu Z Z,et al.Ion Exchange and Adsorption(杨朔,徐环昕,刘坐镇,等.离子交换与吸附),2009,25(1):70

Optimization of preparation of poly(glycidyl methacrylated ivinylbenzene)monolithic column with orthogonal experiments for separation of small molecules

MA Wei1,XU Huanxin1,2,L IU Zuozhen1,2＊,N ING Fanghong1,2
(1.Sta te Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,200237,China;2.Shanghai Huazhen Scientific& Technological Co.,Ltd.,Shanghai 200237,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0175-05

＊通讯联系人:刘坐镇,教授,硕士生导师.Tel:(021)64252342,E-m ail:lzz@ecust.edu.cn.

2009-07-28

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00175