蛋白质高效分离两维色谱柱的选择优化

洪广峰, 高明霞, 晏国全, 关 霞, 陶 芊, 张祥民,2＊

(1.复旦大学化学系,上海200433;2.复旦大学生物医学研究院,上海200433)

蛋白质高效分离两维色谱柱的选择优化

洪广峰1, 高明霞1, 晏国全1, 关 霞1, 陶 芊1, 张祥民1,2＊

(1.复旦大学化学系,上海200433;2.复旦大学生物医学研究院,上海200433)

为了构建高效的离子交换/反相二维液相色谱(IEC/RPLC)分离平台系统,提高复杂蛋白质样品的分离效率,对色谱柱进行了评价与筛选。通过对实际人肝蛋白质样品的分离效果的比较,选择确定了TSKgel D EAE-5PW弱阴离子交换色谱柱(WAX)作为第一维色谱分离柱;考察了同一规格的10支代表性反相色谱柱(250mm×4.6 mm,5μm,30nm,C4、C8或C18),通过评价其对尿嘧啶、硝基苯、萘和芴的分离性能以及对3种标准蛋白质样品的非特异性吸附、对人肝蛋白质样品的WAX馏分的分离效果,最终确定以Jupiter300C4反相色谱柱作为第二维色谱分离柱。对两维色谱柱的选择优化为蛋白质高效分离二维液相色谱平台的搭建提供了可靠基础。

蛋白质组学;多维液相色谱;蛋白质;Top-dow n技术

Abstract:In order to optimize two-dimensional liquid Chromatographic(2D-LC)columns for highly efficient separation of proteins,several liquid Chromatographic columns were investigated and evaluated.Weak anion-exchange(WAX)column was chosen as the first dimension because of its extensive protein separation power.By comparison of different WAX Chromatographic columns for hum an liver protein separation,TSKgelD EAE-5PW column was selected as the first dimension of a2D-LC system.For the second dimension,ten typical reversed-phase(RP)LC columns(250mm×4.6mm,5μm,30nm)were investigated and evaluated.Their silica based RP stationary phases were butyl(C4),octyl(C8)or octadecyl(C18).To evaluate the retention behavior and non-specific protein adsorption ability of these ten columns,four neutral com pounds(uracil,nitrobenzene,naphthalene and fluorene)and three standard proteins(cytochrome C,myoglobin and album in from chicken egg white)were adopted and separated by RPLC.Meantime,WAX fractions were used to investigate the separation ability of different alkyl-bonded silica stationary phase columns for complex protein samples.B y comparison of column separation efficiency,adsorption of intact proteins and sample analysis,Jupiter 300C4column was finally employed for its excellent separation ability.Optimization of WAX and RPLC columns offers reliable foundation for the construction of2D-LC protein separation system s.

Key words:proteomics;multidimensional liquid Chromatography;intact protein;Top-down

随着人类基因组计划的完成,蛋白质组学已成为后基因组研究的重点。相对于基因组学而言,由于蛋白质表达的多样性和翻译后修饰的复杂性,其研究更加依赖于新技术新方法的发展。生物色谱与质谱技术的进步推动了蛋白质组学研究的迅猛发展,形成了基于完整蛋白质分离的Top-dow n路线和基于肽段串级质谱鉴定的B ottom-up路线[1-4]。双向凝胶电泳技术尽管在蛋白质组学研究中的重要性众所周知,然而其本身仍存在一些难以克服的缺陷,如动态范围有限,对样品中低丰度蛋白质、疏水蛋白质以及极酸极碱性蛋白质的分辨能力较差,操作费时费力等[5];B ottom-up技术路线需先进行蛋白质酶解,此步骤产生了比蛋白质样品更加复杂的酶解肽段,对色谱的分离能力和质谱的鉴定速度提出了挑战,还会损失完整蛋白质的信息[6]。

高效液相色谱(HPLC)技术具有快速、高效、自动化程度高等优点,根据G iddings的多维分离系统数学模型[7,8],通过有效正交实现联用的多维液相色谱分离技术具有更大的峰容量,可以实现复杂蛋白质样品的高效分离,而且可以通过增大上样量来分离富集中低丰度蛋白质,因而得到了广泛的应用[9-11]。以往的研究多采用蛋白质酶解肽的多维色谱分离策略,但是越来越多的事实表明,基于蛋白质水平的分离与鉴定更加可靠,而且可以获得蛋白质含量、后修饰等重要信息。高明霞等[12]利用构建的强阳离子交换色谱/反相高效液相色谱(SCX/RPLC)分离系统,对鼠肝蛋白质进行了两维高效分离并将高丰度蛋白质高效去除,大大提高了蛋白质的鉴定数量和可靠性。通过多维液相色谱高效分离实现Top-dow n技术路线分析正成为研究的主要方法[13-17]。这种基于完整蛋白质分离的策略其关键还是要提高复杂蛋白质样品的分离效率,而和SCX色谱柱比较,弱阴离子交换作为第一维色谱可以减少样品酸化过程的损失,增大蛋白质的上样量;RPLC对多维液相色谱总峰容量的贡献很大,可以提高复杂蛋白质样品的分辨率,将其作为第二维色谱还可以在线除盐。因此,优化离子交换色谱/RPLC二维分离系统对于蛋白质的分离有重要的应用意义。本研究对二维分离系统的核心色谱柱进行了筛选,并系统评价和考察了其分离性能,解决了蛋白质水平两维色谱分离系统中色谱柱的最优化问题。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

岛津LC-2010高效液相色谱仪(日本Shim adzu公司),配有泵单元、四元低压梯度单元、溶剂真空脱气机、自动进样器、柱温箱、紫外可见检测器和CLASS-VP工作站。十万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司),数控超声波清洗器(型号DS-5510D TH,上海生析超声仪器有限公司)。

甲醇(HPLC纯,美国Fisher公司),乙腈(ACN,HPLC纯,德国M erck公司),三氟乙酸(TFA,HPLC纯,美国Sigm a公司);标准蛋白细胞色素C(cytochrom e C,Cyt-C)、马心肌红蛋白(m yoglobin,M Y O)和鸡卵白蛋白(album in from chicken egg w hite,ALB)购自美国Sigm a公司;用于色谱柱测试的化合物尿嘧啶、硝基苯、萘、芴为分析纯,购自中国医药集团化学试剂公司上海分公司;其他试剂均为国产分析纯试剂;实验用水为M illi-Q去离子水。

健康人肝组织样品由中国人肝组织提供。二硫苏糖醇(D TT)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和苯甲磺酰氟(PMSF)为Am resco(USA)分装,购自上海华舜生物工程有限公司。考马斯亮蓝R-250(B io-Rad,USA)。

样品制备:将人肝组织切成小块,用冰生理盐水(0.9%N aCl溶液)清洗3次以除去体液及血液中一些可能的污染物。然后称重,以1∶8(g∶mL)的比例加入提取液(1mmol/LPMSF,50mmol/L D TT,10mmol/L Tris-HC l,pH7.5),然后置于玻璃匀浆器内进行手动匀浆至组织完全破碎,上述整个匀浆过程在冰浴中进行。匀浆液混旋30m in,在4℃条件下15 000g离心30m in,取上清液即为提取蛋白,-80℃保存备用,蛋白质提取液用B radford法定量。

1.2 实验步骤

1.2.1 人肝蛋白质样品的一维WAX分离

蛋白质弱阴离子交换(WAX)柱:Tosoh TSKgel D EAE-5PW(东京,日本),内径是7.5mm,柱长为75mm,采用10μm,100nm填料,分析柱前加一个2cm长、内径为4.6mm的保护柱以防止污染或堵塞分析柱,保护柱的填料粒径为20μm。流动相A:10mmol/L Tris-HC l(pH7.5);流动相B:10mmol/LTris-HC l-500mmol/L氯化钠(pH 7.5)。流动相流速设定为0.5mL/m in。流动相洗脱梯度为:0%B15m in,于80m in内线性上升至30%B,于22m in内线性上升至100%B,保持5m in,于3m in内降至0%B。上样量为2m g/次,平行进行3次实验。收集的馏分经过冷冻干燥后置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.2 RPLC色谱柱柱效测试

以尿嘧啶、硝基苯、萘和芴为标准物质,分别称取一定质量的上述4种化合物,以甲醇作为溶剂,配制成1g/L的标准溶液备用。使用时取等体积的上述4种标准溶液混合,并加入30%ACN水溶液稀释至终质量浓度为0.1g/L。RPLC色谱柱规格:250mm×4.6mm,粒径5μm,孔径30nm,硅胶基质,键合固定相为C4、C8或C18,购自国内外不同厂家,详细参数见表1。柱效评价采用色谱柱出厂报告上的色谱条件,样品进样体积为5μL。

表1 10支反相色谱柱的参数Table1 Pa ram e te rs of ten RPLC colum ns

1.2.3 标准蛋白质的RPLC分离

分别称取一定质量的Cyt-C、M Y O和ALB3种标准蛋白质样品,以去离子水作为溶剂,配制成10 g/L的标准溶液备用。使用时取等体积的上述3种标准蛋白质溶液混合,并加入去离子水稀释至终质量浓度为1g/L。

色谱条件:流动相A:95%H2O-5%ACN-0.05%TFA;B:95%ACN-5%H2O-0.05%TFA。流动相洗脱梯度为:10m in内由0%B线性上升至25%B,20 m in内由25%B线性升至40%B,8m in内由40%B线性升至80%B,3m in内降至0%B。流速设定为1mL/m in。检测波长为215nm。样品进样体积为30μL。定量方法使用面积归一化法。

1.2.4 人肝蛋白质WAX馏分的二维RPLC分离

样品准备:取一定量的一维WAX冻干馏分溶解于1.2.3节RPLC的流动相A相,充分混旋,离心,取上清溶液备用,溶液中蛋白质含量用B radford方法测定,由此确定二维RPLC的上样量,保证每根色谱柱的分离分析条件的一致性。色谱条件同1.2.3节。

2 结果与讨论

2.1 人肝蛋白质样品的第一维离子交换色谱分离

常用的离子交换色谱柱有阳离子交换柱和阴离子交换柱,阳离子交换色谱通常需在酸性条件下上样,但在中性溶液中提取的蛋白质经过酸化处理会导致大量蛋白质沉淀,使用阴离子交换色谱则能够避免蛋白质沉淀。阴离子交换色谱柱有强阴离子交换和弱阴离子交换两种,在蛋白质分离中应用比较广泛的是弱阴离子交换色谱柱,因此本研究选择了两款弱阴离子交换柱进行比较。如图1所示,无孔的弱阴离子交换柱TSKgel D EAE-N PR(图1b)尽管对于一些在大孔弱阴离子交换柱TSKgel D EAE-5PW(图1a)上强保留的蛋白质分离效果比较好,分离速度也比较快,但色谱柱的样品容量小,不能满足二维色谱分离过程中第二维上样量的需要,因此实验选取了具有更大上样量的弱阴离子交换柱TSKgel D EAE-5PW进行人肝蛋白质样品的第一维分离。通过对梯度条件的优化,最终确定了图1中使用的流动相梯度条件。1D-WAX馏分收集采用按色谱峰收集的方法,具体如图2中所示,每次上样2 m g,重复进样3次平行收集馏分,然后冻干,置于-80℃冰箱中保存以便进行2D-RPLC色谱条件的考察优化。由图2也可以看出,在优化后的色谱条件下,3次平行进样的色谱分离重现性很好。

图1 不同WAX色谱柱分离人肝蛋白质样品的色谱图Fig.1 Chrom a togram s of hum an live r p rote ins with diffe ren t WAX ch rom a tograp hic co lum ns

图2 人肝蛋白质样品的一维WAX色谱分离图Fig.2 Ch rom a togram of hum an live r p ro te ins using1D-WAX liqu id ch rom a tograp hy

2.2 RPLC色谱柱柱效测试

2.2.1 柱效评价

以尿嘧啶、硝基苯、萘和芴为标准物质对色谱柱柱效进行评价。液相色谱系统的死时间以尿嘧啶的出峰时间计,理论塔板数按芴来计算,根据岛津LC-2010自带的工作站CLASS-VP软件,计算色谱峰的不对称因子(As)、理论塔板数(NT)和有效塔板数(Neff)等色谱柱参数,具体结果详见表2。

表2 10支反相液相色谱柱柱效评价Tab le2 Column efficiency evaluation of ten RPLC columns

由上述结果可以看出色谱柱4、9、10的柱效较低,由表1可以看出它们的填料含碳量较低;色谱柱6柱效较高,柱压降也比较高,可能是色谱柱的填料装填比较紧密;色谱柱1、2、3、5和8的柱效比较接近,需要比较其对标准蛋白质样品的分离情况以作进一步的筛选考察。

2.2.2 非特异性吸附考察

硅胶基质的色谱填料具有传质快、不溶胀、耐高压等优点。通过在多孔硅胶基质表面键合不同的功能基团如氨基、氰基、二醇基、烷基等可以制备具有多种功能性质的色谱填料。反相色谱填料通常是在硅胶基质表面键合上不同长度的烷基链如C4、C8和C18等,残余的自由硅羟基使用“封尾”试剂如三甲基氯硅烷(TMSC l)进行烷基化处理,以消除其对样品分离过程的不利影响。然而随着烷基化程度的提高,位阻造成的影响使少量硅羟基难以被完全硅烷化,所以不同生产厂家的色谱柱在使用过程中对样品的非特异性吸附也不同,对于珍贵的人肝蛋白质样品来讲,考察不同填料对蛋白质的非特异性吸附非常重要。

本文采用Cyt-C、M YO和ALB做标准蛋白质进行考察,通过对照空白实验并利用面积归一化法对蛋白质在不同色谱柱上的残留进行计算,结果发现,Cyt-C与M YO在所测试的色谱柱上几乎没有残留,而ALB的残留相对比较大,这可能与ALB的相对分子质量相对较大而疏水性更强有关,表2给出了ALB的非特异性吸附的数据。可以看出,色谱柱4、7和10的非特异性吸附比较弱;色谱柱6、8和9的非特异性吸附较强;色谱柱1、2、3和5的测试结果比较接近。综合考虑柱效、柱压降、蛋白质的非特异性吸附以及色谱柱填料的比表面积、含碳量、使用的pH范围,选取色谱柱1和2作进一步的研究。

2.3 标准蛋白质与人肝蛋白质WAX馏分的RPLC分离

图3是RP色谱柱1、2对标准蛋白质样品Cyt-C和ALB的分离图,可以看出两款色谱柱对ALB的分离峰形都比较好;但是对于Cyt-C的分离,色谱柱2具有更好的分离度。

图3 标准蛋白质样品Cyt-C和ALB在两支RP色谱柱上的分离图Fig.3 Chromatograms of Cyt-C and ALB on two RP columns

之后,实验选用了1D-WAX的馏分6(见图2)对两根色谱柱做进一步的考察。通过色谱图(见图4)的比较可以发现保留能力一般的蛋白质样品在色谱柱1和色谱柱2上具有相似的分离能力;而对于强保留的蛋白质即疏水性比较强的蛋白质,色谱柱2具有更加优越的分离性能。因此色谱柱2(Jup iter300C4,美国Phenom enex公司)被选作人肝蛋白质样品多维色谱分离的第二维色谱柱。这样就可以在第一维尽量不损失样品完整性的基础上,最大程度地提高蛋白质在第二维的分离效率,不仅可以得到更多中低丰度蛋白质的峰信息,方便地对蛋白质进行定量,还可以简化后续的液相色谱馏分中蛋白质的复杂程度,提高其质谱鉴定效率。

图4 人肝蛋白质样品1D-WAX馏分6在RP色谱柱1和2上的分离图Fig.4 Chromatograms of1D-WAX fraction6of hum an live r p rote ins on RP column 1 and 2

3 结论

本文系统考察了蛋白质多维液相色谱分离的色谱柱选择和条件优化。通过分离分析人肝蛋白质样品选择了Tosoh公司的具有大上样量的TSKgel D EAE-5PW色谱柱作为第一维WAX色谱柱;通过对标准样品和人肝蛋白质样品WAX馏分的分离条件考察,选择了美国Phenomenex公司的Jupiter

300C4 反相色谱柱作为第二维RPLC色谱柱,构建了离线的IEC/RPLC二维蛋白质高效分离模式。这对于复杂生物样品中蛋白质的分离鉴定尤其是中低丰度蛋白质的分离和鉴定是非常重要和必要的。

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Optimization of two-dimensional high performance liquid chromatograp hiccolumns for highly efficient separation of in tact proteins

HONG Guangfeng1,GAO M ingxia1,Y AN Guoquan1,GUAN Xia1,TAO Q ian1,ZHANG Xiangm in1,2＊
(1.Department of Chemistry,Fudan University,Shangha i 200433,China;2.Institutes of Biomedica l Sciences,Fudan University,Shanghai 200433,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0158-05

＊通讯联系人:张祥民,教授,博士生导师.Tel:(021)65643983,E-mail:xmzhang@fudan.edu.cn.

国家重点基础研究发展规划(“973”)项目(No.2007CB914100/3)、国家高技术研究发展计划(“863”)项目(No.2006AA02A308)和国家自然科学基金项目(No.20705006).

2010-01-05

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00158